ROR/RZR рецепторы: взаимодействие с ДНК
Члены подсемейства связываются с ДНК в форме мономеров и узнают гормон-чувствительные элементы ( RORE ), представляющие собой расширенные по 5'-концу полусайты с мотивом A/GGGTCA [ Giguere, ea 1994 , Medvedev, ea 1996 , Schrader, ea 1973 , Greiner, ea 1996 , Carlberg, ea 1994 , Giguere, ea 1995 , Winrow, ea 1998 ). В узнавании RORE участвует не только собственно ДНК-связывающий домен рецептора (на примере RORaльфаl), но и прилегающие к нему последовательности N-концевого регуляторного домена и шарнирной области, причем последняя, по данным делеционного и мутационного анализа, играет ведущую роль в узнавании 5'- расширения сайта связывания, что характерно и для других мономерных ядерных рецепторов. Обе прилегающие к ДНК-связывающему домену рецептора последовательности по данным, полученным с гибридными рецепторами, способны действовать как автономные элементы дискриминации между различными RORE [ Giguere, ea 1994 , Giguere, ea 1995 ]. Механизм участия прилегающей к ДНК связывающему домену с N-конца последовательности в узнавании рецептором разных RORE, возможно, связан с возникновением изгиба ДНК за счет шарнирной области рецептора. Предполагается, что N-концевая последовательность обеспечивает правильную взаимную ориентацию цинковых пальцев и прилегающей к ним С-концевой последовательности. Хотя функциональное значение вызываемого ядерными рецепторами и другими транскрипционными факторами перегиба ДНК остается неясным, интересно отметить, что угол перегиба индуцируемого мономеоными RORaльфаl и RORaльфа2 оказывается существенно большим по сравнению с наблюдаемым в присутствии димеризующихся рецепторов [ McBroom, ea 1995 ]. Равновесная константа диссоциации ряда изученных природных RORE для RZRaльфа/RORoc находится в диапазоне от 0,6 до 3,2 нМ [ Schrader, ea 1973 ]. С помощью анализа влияния метилирования ДНК на белково-нуклеиновое взаимодействие показано, что RORaльфаl контактирует с тремя гуанинами по большой бороздке 3'-полусайта RORE и тремя аденинами по малой бороздке гексануклеотидного 5'-расширения сайта. Результаты экспериментов с делеционными вариантами рецептора позволяют предполагать, что рецептор ориентирован преимущественно вдоль одной поверхности спирали ДНК таким образом, что цинковые пальцы рецептора взаимодействуют с большой бороздкой 3'-полусайта, а прилегающая последовательность шарнирной области - с малой бороздкой 5'- расширения RORE [ Giguere, ea 1995 , McBroom, ea 1995 ]. Эксперименты с этилированном фосфатных остатков в RORE показали, что помимо специфических взаимодействий с основаниями в связывании рецептора принимает участие и фосфодиэфирный остов ДНК, причем рецептор имеет контакты с фосфатами как транскрибируемой цепи ДНК (по центру RORE), так и комплементарной цепи (по границам RORE) [ Giguere, ea 1995 ]. Не исключено, что в некоторых случаях предпочтительной функционально активной формой рецептора является гомодимер, поскольку RZRбета, хотя и связывался с мономерным RORE, но повышал транскрипцию только при наличии в промоторе двух полусайтов с 5'-расширениями (прямых повторов со спейсером из шестидевяти оснований или палиндромов без спейсера). Только спейсер необходимого размера между двумя RORE обеспечивал связывание второй молекулы рецептора. Следует, однако, отметить, что кооперативности в связывании двух молекул RZRбета не наблюдалось, и эксперименты с гибридными рецепторами в клетках CV1 :не выявили образования гомодимеров in vivo [ Greiner, ea 1996 , Carlberg, ea 1994 ]. Наличие сдвоенного RORE выявлено в промоторе гена окситоцина с центрами -180 и -160. При этом оба сайта связывания RORaльфа были существенны для проявления стимулирующего действия рецептора на транскрипцию [ Chu, ea 1999 ]. Причины функциональной активности сдвоенных RORE в отсутствие физически выявляемой димеризации рецептора остаются неясными. Обогащенное AT основаниями 5'-расширение играет существенную роль в дискриминации сигнала разных членов подсемейства [ Giguere, ea 1994 ]. Так, например, RORE промотора гена 5'-липоксигеназы человека , представленный последовательностью CAAAATGGGTCA, связывается с RZRaльфа и RORaльфаl, но не с RORaльфа2 и RORaльфа3 [ Steinhilber, ea 1995 ]. Аналогичная ситуация имеет место в случае промотора гена аполипопротеина А-1 крысы, в котором богатое AT 5'-расширение RORE перекрывается с ТАТА-боксом [ Vu-Dac, ea 1997 ]. Замены в базовой гексануклеотидной последовательности, как это имеет место в RORE того же гена у мыши, существенно снижает сродство к рецептору и эффективность трансактивации [ Vu-Dac, ea 1997 ].
RORE не являются абсолютно избирательными в отношении рецепторов группы ROR/RZR. Например, сиротские рецепторы Rev-erb aльфа и Rev-erb бета взаимодействуют как мономеры с RORE для RORaльфаl и блокируют трансактивирующее действие последнего, хотя сами по себе-неактивны [ Forman, ea 1994 ]. Аналогичным образом сиротский рецептор RVR , не обладающий собственной транскрипционной активностью в использованной системе, конкурентно ингибировал активирующее действие RORaльфа2 за счет связывания с тем же RORE [ Retnakaran, ea 1994 ]. В ряде генов ROREs входят в состав чувствительных элементов других ядерных рецепторов, в частности, сдвоенных полусайтов для димерных рецепторов (например, (COUP-TF)2, PPARaльфа/RXRaльфа, RAR/RXR), что существенно расширяет возможности регуляции соответствующих генов, включая эффекты кооперативности, конкуренции и взаимозаменяемости в действии разных рецепторов и других транскрипционных факторов [ Schrader, ea 1973 , Winrow, ea 1998 , Tini, ea 1995 , Matsui, ea 1996 , Matsui, ea 1997 ].
