Микоплазмы: ген ftsZ и табулины
FtsZ всех изученных бактерий содержат консервативный N-концевой участок, сайт связывания GTP и вариабельный, гидрофильный С-концевой участок ( Margolin et al., 1996 ). Аналогичные свойства и доменная организация белка характерны для тубулинов эукариот. В связи с этим предложена гипотеза, что FtsZ прокариот могут быть эволюционными предшественниками тубулинов эукариот ( Bermudes et al., 1994 ; Erickson, 1995 , Lowe, Amos, 1998 ). Для построения эволюционных отношений между FtsZ и тубулинами эукариот и изучения фундаментальных основ клеточного деления бактерий нужны исследования генов и белков FtsZ на модели минимальной клетки микоплазм. В связи с этим в Институте цитологии РАН занимались изучением гена ftsZ Acholeplasma laidlawii .
По результатам множественного выравнивания первичных структур генов ftsZ ряда бактерий и микоплазм было выбрано и синтезировано несколько пар вырожденных праймеров, соответствующих высококонсервагивным участкам гена ftsZ. С помощью этих праймеров на матрице ДНК A. laidlawii был амплифицирован фрагмент гена ftsZ размером 520 н. п. ( Кукекова и др., 1999а ). Этот фрагмент был использован в качестве гибридизационного зонда с целью поиска генов ftsZ других микоплазм. Результаты блотгибридизации с ДНК микоплазм шести видов оказались отрицательными, что согласуется с результатами секвенирования фрагмента 520 н. п. и сравнения его с генами ftsZ других бактерий. Так, нуклеотидная последовательность фрагмента обладает 63.6% идентичности с соответствующим участком гена ftsZ Bacillus subtilis и 57.9% - с Е. coli при всего 30% идентичности с соответствующими участками ftsZ M. genitalium и M. pneumoniae .
С помощью этого же зонда и блотгибридизации с ДНК A. laidlawii, обработанной рестриктазой Hindi II, был выявлен фрагмент 2.4 т. п. о., содержащий полноразмерную копию гена ftsZ. Этот фрагмент был клонирован и секвенирован. В составе фрагмента был идентифицирован ген ftsZ, фланкированный двумя другими ОРС, которые были идентифицированы ( Кукекова и др., 1996 ). Трансляция секвенированной последовательности позволила определить полипептидную цепь белка FtsZ, состоящего из 373 аминокислот с расчетной мол. массой 39.9 кДа. Белок FtsZ A. laidlawii содержит большое количество аланина (10.1%), глицина (9.9%) и валина (9.1%), малое - триптофана (0.2%) при отсутствии цистеина. В составе гена находится участок, кодирующий консервативный GTP-связывающий домен . Этот домен A. laidlawii (Gly-Gly-Oly-Thr-Thr-Gly-Thr-Gly) полностью соответствует глицин-богатому домену бактерий, обладающих клеточной стенкой, и на одну аминокислоту отличается от соответствующего домена других микоплазм.
Фрагмент гена ftsZ (520 н. п.) был экспрессирован в клетках Е. coli. Поликлональные антитела, которые были получены против химерного полипептида, содержащего фрагмент белка FtsZ A. laidlawii, на белковом блоте реагировали с единственным белком A. laidlawii с мол. массой 40 кД ( Кукекова и др., 19996 ).
Сравнение аминокислотных последовательностей FtsZ бактерий, архебактерий и тубулинов эукариот показало, что белки FtsZ двух видов архебактерий Pyrococcus woesei и Haloferax volcanii обладают более высокой гомологией с бактериальным FtsZ, тогда как FtsZ Halobacterium salinarium более сходен с эукариотическим тубулином ( Margolin et al., 1996 ). Филогенетическое древо, реконструированное на основе сопоставления аминокислотных последовательностей FtsZ, отличается от предложенных ранее эволюционных построений, согласно которым все архебактерий рассматривались как единая группа, более родственная эукариотам, чем бактериям ( Bauman, Jackson, 1996 ).
Анализ последовательностей генов 16S рРНК используется как универсальный подход для определения эволюционного родства микроорганизмов.
Однако исследования гена ftsZ показывают, что он также отвечает основным требованиям, необходимым для проведения филогенетического анализа: широко распространен, важен в функциональном отношении и достаточно протяжен ( Woese, 1987 ). На основании сравнения последовательностей генов 16S рРНК род Acholeplasma относят к классу Mollicutes, к которому принадлежат также роды Mycoplasma, Spiroplasma, Ureaplasma и Апаеroplasma ( Maniloff, 1983 ). Считается, что представители перечисленных таксонов имеют монофилетическое происхождение и являются ветвью грамположительных бактерий Lactobacillus ( Maniloff, 1992b ). Однако результаты, полученные при сравнении нуклеотидных последовательностей гена ftsZ, не совпадают с таковыми для генов 16S рРНК. A. laidlawii обнаруживает большую эволюционную близость с грамположительной бактерией В. subtilis и грамотрицательной Е. coli, но низкую гомологию с представителями рода Mycoplasma.
Аналогичные результаты были получены при сравнительном анализе транслированных аминокислотных последовательностей белка теплового шока DnaK ( Вонский и др., 1998 ).
