Клостридии: конструктивный метаболизм
Потребности клостридиев в питательных веществах отличаются большим разнообразием. Как правило, клостридии могут расти только на сложных, богатых органическими соединениями средах. Многие клостридии выделяют экзоферменты, расщепляющие макромолекулы (углеводы, белки) на составляющие их мономеры. До сих пор только небольшое число видов удалось культивировать в лаборатории на синтетической среде. Для них выявлена потребность в витаминах (главным образом группы В) и наборе аминокислот. Интересная особенность эубактерий из рода Clostridium - дальнейшее развитие способности вовлекать углекислоту в клеточный метаболизм. У Clostridium kluyveri , растущего на смеси С2-соединений ( этанол + ацетат ), до 30% углерода клетки возникает из углерода СО2. Для Сlostridium aceticum и других видов, осуществляющих гомоацетатное брожение , показана способность к хемолитоавтотрофному росту на минеральной среде за счет превращения СО2 и Н2 в ацетат:
4Н2 + 2СО2 приводит к СН3-СООН + 2Н2О.
В группу гомоацетатных бактерий , помимо некоторых представителей рода Clostridium, входят организмы, принадлежащие к родам Acetobacterium , Acetogenium , Eubacterium , Butyribacterium и др. При росте на минеральной среде энергию ацетогены получают в процессе анаэробного дыхания с использованием Н2 в качестве донора электронов, а СО2 - конечного их акцептора. Исходными метаболитами для биосинтетических путей служат ацетил-КоA (ключевой метаболит пути фиксации СО2 ацетогенами) и пируват , образующийся из последнего в реакции восстановительного карбоксилирования .
Пути включения СО2 в клеточный метаболизм клостридиев различны. Углекислота может использоваться ими в качестве конечного акцептора электронов, что приводит к прямому восстановлению СО2 до формиата . Донорами электронов в этой реакции служат восстановленный ферредоксин или НАД*Н2 . Реакция может служить способом удаления избытка восстановительных эквивалентов, образующихся при брожении, т.е. быть необходимой для сбалансирования окислительных и восстановительных этапов в энергетическом метаболизме. Образовавшийся в результате восстановления СО2 формиат может подвергаться дальнейшему восстановлению и служить источником метальных групп, используемых для клеточных биосинтезов.
Для разных видов клостридиев показана активная фиксация СО2 на С2- и С3-соединениях, таких как ацетил-КоA , пропионил-КоA , пируват , в реакциях восстановительного карбоксилирования , например:
ацетил-КоA + СО2 = Фд(восст) приводит к пируват + КоA-SH + Фд(ок).
Механизм, по которому происходит автотрофная фиксация С02 у клостридиев, осуществляющих гомоацетатное брожение , изображен на рис. 62 .
Дальнейший шаг вперед по пути независимости от среды связан с распространением у этой группы эубактерий способности фиксировать атмосферный азот (небольшая способность к фиксации N2 обнаружена у пропионовых бактерий ). Первый анаэробный азотфиксатор был выделен из почвы С.Н.Виноградским и назван им в честь Л.Пастера Clostridium pasteurianum .
Молекула N2 чрезвычайно прочна. Чтобы разорвать три связи между двумя атомами в молекуле N2, необходимо затратить 941 кДж/моль, поэтому восстановление N2 до NH3 химическим путем - очень энергоемкий процесс. Фиксация молекулярного азота, до сих пор обнаруженная только у прокариот, осуществляется с помощью ферментной системы - нитрогеназы, состоящей из двух компонентов: малого, содержащего железо и серу ( Fe-белок ), и большого, в состав которого дополнительно входит молибден ( MoFe-белок ). Соотношение между ними у разных азотфиксирующих прокариот колеблется от 1:1 до 2:1, хотя в целом нитрогеназы из разных источников обнаруживают значительное сходство. (У некоторых азотфиксаторов вместо или наряду с молибденом в составе большой субъединицы обнаружен ванадий, у других найдена нитрогеназа, содержащая только железо).
Для функционирования нитрогеназы необходим источник энергии в виде АТФ, ионы магния и восстановитель с низким окислительно- восстановительным потенциалом. У Сlostridium pasteurianum непосредственным донором электронов для восстановления N2 служит восстановленный ферредоксин , электроны с которого поступают сначала на Fe-белок нитрогеназы ( рис. 63 ). Восстановленный Fe-белок образует комплекс с молекулами Mg и АТФ, что приводит к сдвигу окислительно- восстановительного потенциала FeS-центра белка от -290 до -400 мВ. Это делает возможным последующий перенос активированных электронов на MoFe- белок, в активном центре которого происходит восстановление N2. Перенос 1 электрона на MoFe-белок сопровождается гидролизом как минимум 2 молекул АТФ. Так как за один раз FeS-центрами ферредоксина, Fe- и MoFe- белков может быть перенесено не более 2 электронов, а для восстановления N2 до аммиака необходимо 6 электронов, следовательно, процесс должен состоять не меньше чем из трех последовательных стадии восстановления:
N---N переходит в HN=NH переходит в H2N-NH2 переходит в 2NH3, где
N---N - тройная связь между атомами N,
все реакции идут в присутствии двух электронов,
HN=NH - диимин,
H2N-NH2 - гидразин.
В течение длительного времени не удавалось обнаружить какие-либо частично восстановленные промежуточные соединения. Единственным идентифицированным продуктом восстановления был аммиак . Быстрая остановка нитрогеназной реакции в кислой или щелочной среде позволила обнаружить гидразин . Вероятно, промежуточные соединения в процессе восстановления молекулы N2 остаются прочно связанными с нитрогеназой. По проведенным измерениям, для восстановления 1 молекулы N2 требуется не менее 12 молекул АТФ . Таким образом, процесс азотфиксации связан с затратой большого количества клеточной энергии. Для ассимиляции 1 мг N2 Сlostridium pasteurianum в процессе брожения перерабатывается примерно 500 мг сахара.
Помимо N2 нитрогеназа может восстанавливать рад других субстратов, таких как N2O, C2H2 и его аналоги, N3-, CN-. В отсутствие N2 нитрогеназа катализирует выделение молекулярного водорода в реакции, протекающей с затратой АТФ. Это дает основание предполагать, что нитрогеназа является результатом дальнейшего усложнения молекулы гидрогеназы, приобретшей способность катализировать не только восстановление протонов, ведущее к выделению Н2, но и ряд других субстратов, в том числе и N2.
