Мутации известные: методы обнаружения: общие сведения
Методы обнаружения мутаций предполагают обязательное секвенирование содержащих их сегментов ДНК с целью точной идентификации нуклеотидных нарушений, оценки их фенотипического проявления и определения причастности к развитию болезни. Поэтому они редко используются в практической диагностике и при популяционном скрининге гетерозигот. После описания мутации появляется возможность ее анализа более простыми способами, не требующими секвенирования.
Мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов , могут быть выявлены с помощью нативного электрофореза в полиакриламидном или агарозном гелях.
Из миссенс-мутаций наиболее просто диагностируются те замены нуклеотидов, которые приводят к исчезновению или образованию сайта узнавания для какой-нибудь из рестриктаз. Они выявляются по изменению длины амплифицированного фрагмента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой. Поэтому сразу после идентификации мутации проводится компьютерный поиск возможных сайтов рестрикции в месте локализации замены основания. Вероятность такого события довольно велика, так как для каждой из нескольких сотен известных в настоящее время рестрикционных эндонуклеаз сайтом узнавания служит своя специфическая последовательность ДНК, средние размеры которой составляют 5-6 нуклеотидов.
Методы выявления мутаций довольно разнообразны и постоянно совершенствуются. В первую очередь, молекулярному анализу подвергают те гены, повреждения которых сопровождаются развитием наиболее частых заболеваний. Исследования проводят либо в семьях высокого риска, где уже имеются больные с тем или иным моногенным заболеванием с целью выявления гетерозиготных носителей, либо непосредственно в популяциях, где имеется большая выборка больных и можно предполагать высокую частоту гетерозиготных носителей мутаций. При этом выбор конкретных схем идентификации мутантных аллелей зачастую определяется диагностическими возможностями лабораторий и стоимостью анализов. Особое внимание уделяют поиску тех аллелей, которые встречаются в популяциях с высокой частотой. Именно для таких мутаций разрабатывают более простые и эффективные методы молекулярной диагностики, позволяющие тестировать больных и проводить скрининг гетерозигот среди их родственников или среди определенных групп населения.
Важнейшей характеристикой мутантного аллеля является его корреляция с тяжестью течения заболевания, т. е. фенотипическое выражение мутации в гомозиготном и в гетерозиготном состояниях, а также в компаунде с другими мутантными аллелями того же гена. Для многих моногенных болезней обнаружено большое число аллелей, которые по своему клиническому проявлению могут быть подразделены на различные группы: от очень мягких, оказывающих незначительный повреждающий эффект, до летальных или полулетальных, обусловливающих смерть пациентов в раннем возрасте. Таким образом, молекулярная диагностика мутаций может иметь определяющее значение для прогнозирования развития заболевания и выбора адекватной тактики лечения. Подобные скринирующие программы в настоящее время разработаны и успешно осуществляются во многих странах для таких распространенных заболеваний, как серповидно-клеточная анемия , муковисцидоз [ Hubert R. et al., 1994 ].
