ASO метод обнаружения мутаций
Универсальным методом детекции замен оснований является метод аллель-специфических олигонуклеотидов - ASO, который включает амплификацию фрагментов ДНК и последующую дот- или слот- гибридизацию с мечеными аллель-специфическими олигонуклеотидами [ Reiss J., 1991 ]. Для этого синтезируют два типа олигонуклеотидных последовательностей обычно размером 19 п.о., в которых мутантный сайт занимает центральное положение. Каждый из этих олигонуклеотидных зондов комплементарен нормальному или мутантному вариантам ДНК, соответственно. Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы дуплексы образовывались только при полной комплементарности гибридных пар. В этих условиях амплифицированные фрагменты ДНК без мутации будут гибридизоваться только с нормальным зондом, ДНК гомозигот по мутации - только с мутантным и ДНК гетерозигот - с обоими олигонуклеотидами ( рис. 4.10 ). Для уменьшения перекрестной аллель-специфической гибридизации в реакционную смесь добавляют 30-кратный избыток конкурентного немеченого олигонуклеотидного ДНК-зонда.
Разработаны удобные модификации метода ASO с использованием аллель-специфических ДНК-зондов, меченных биотином или пероксидазой хрена [ Лебедева И.В. и др., 1994 ].
Наиболее быстрым, экономичным и удобным методом сканирования точечных мутаций является модифицированный вариант ASO , так называемая гибридизационная система обратного дот-блота (reverse dot-blot hybridisation system) [ Saiki R.K. et al., 1989 ]. Метод позволяет одновременно скринировать сразу много точечных мутаций и доступен автоматизации [ Chebab F.F., 1993 ]. В этом случае проводят гибридизацию меченых продуктов ПЦР, обычно представляющих собой отдельные экзоны, с фиксированными на нейлоновых фильтрах аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами (ASO).
Предварительную иммобилизацию мутантных и нормальных ASO- зондов на мембранах осуществляют за счет присоединения гомополимерных Т-хвостов с дезоксирибонуклеотидтрансферазой на конце. При этом олигонуклеотидные последовательности остаются свободными и могут участвовать в гибридизации с мечеными амплифицированными фрагментами ДНК. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК радиоавтографические или цветные пятна на фильтрах становятся заметными только в местах локализации олигонуклеотидов, полностью комплементарных тестируемой геномной ДНК. Реакцию обычно проводят в присутствии ионов тетраалкиламмония, уменьшающих зависимость температуры плавления от композиции оснований. Это позволяет использовать одинаковые условия гибридизации для различных олигонуклеотидов, т. е. вести поиск сразу нескольких типов мутаций, локализованных в одном и том же экзоне гена.
Данный метод положен в основу разработки специальных систем, предназначенных для одновременной детекции наиболее распространенных мутаций в исследуемом гене. Система представляет собой ленточный фильтр (стрип) с нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из которых соответствует определенной мутации. Стрип помещают в раствор со смесью тех меченых амплифицированных экзонов, которые могут содержать тестируемые мутантные аллели и создают условия для аллель-специфической гибридизации. Таким способом сканируют одновременно 42 мутации, ответственные за серповидно-клеточную анемию , 34 мутации - при муковисцидозе [ Chebab F.F., 1993 ].
