Разрезание ДНК
Рекомбинация между короткими прямыми повторами может происхо- дить как в результате разрушения ДНК, так и в результате ошибок репликации . Было предположено, что процесс может использовать следующие шаги [ 49 , 59 ]: (i) между короткими прямыми повторами в молекуле ДНК происходит двухцепочечный разрыв; (ii) экзонуклео- тическое разрушение, инициирующееся в разрыве, приводит к образо- ванию отрезков в одноцепочечной ДНК; (iii) короткие комплементар- ные последовательности подвергаются отжиганию разрушением; (iv) щели или одноцепочечные хвосты хвосты, вероятно, присутствующие на получающихся молекулах, репарируются или подрезаются, соответ- ственно; (v) разрезы, образующиеся во время репарации ,запаиваются ДНК-лигазой. Таким образом может возникнуть делеция , уничтожающая район между повторами и один из повторов. Более сложные события, такие как инверсии или дупликации , требуют взаимодействие двух молекул ДНК.
Рекомбинации между короткими прямыми повторами, опосредованая разрывом ДНК, были продемонстрированы на плазмидах , линеаризова- ных in vitro и введенных трансформацией в клетки E.coli. Такие плазмиды закольцовываются in vivo и часто одновременно подвергаются делециям. В исследовании [ 47 , 48 , 49 ], для трансформации установленных клеток E.coli была использована линейная плазмидная ДНК с короткими, способными к сцеплению концами (pBR322,разрезан- ная различными рестрикционными ферментами и очищеная гель-элект- рофорезом). Эффективность трансформации была примерно в 100 раз ниже, чем для кольцевой ДНК. Большинство трансформантов (~90%) содержали плазмиды,идентичные родительским молекулам, и,возможно, были получены in vivo путем связывания коротких, способных к сцеплению концов. Оставшиеся трансформанты содержали модифициро- ванные плазмиды, которые часто были меньще, чем родительские, и возникали в результате делеций. Наблюдались и такие более сложные события, как инверсии и дупликации. Неудивительно, что линейные молекулы с обрезанными концами поставляли большее количество делеций (до 80%), хотя эффективность трансформации была уменьшена в дальнейшем с 5 до 10 раз [ 48 , 49 ].
При анализе плазмид, получавшихся из Sal1-разрезаных pBR322, были найдены два типа делеций. Первый возникал получен при реком- бинации между одним коротким одноцепочечным концом и комплемен- тарной последовательностью внутри молекулы. Второй получался при рекомбинации между двумя повторами (20 и 19 н.п., имеющими 16 или 8 н.п. гомологию с 1 несовпадением в двух случаях, проанализиро- ваных секвенированием), которые оба являются внутренними по отношению к молекуле [ 49 ]. Похожие события были зафиксированы при анализе двух плазмид, произошедших от pBR322 и линеаризованых BamHI [ 25 , 83 ]. Это указывает, что делеции могут быть результатом рекомбинации между короткими гомологичными последовательностями, которая следует за разрывом ДНК.
Наблюдались также более сложные преобразования, чем делеции, происходящие при соединении молекул ДНК с короткими комплементар- ными одноцепочечными концами [ 42 ]. Использовались две различные плазмиды, одна, несущая 5'-конец гена Cm(r) на одном сегменте EcoRI, и другая, несущая 3'-конец этого гена на другом сегменте EcoRI. Объединение концов двух сегментов EcoRI может создать третью плазмиду, несущую целиком ген Cm(r). Две плазмиды были разрезаны EcoRI, сегменты введены трансформацией в E.coli, и были получены клоны Cm(r). Они содержали плазмиды с ожидаемой структу- рой. Похожие результаты были получены с другой парой EcoRI- сгенерированых сегментов ДНК, каждый из которых нес ген устойчивости к антибиотикам (Ap(r) или Km(r)), и соединенными in vivo, чтобы получить плазмиды, кодирующие устойчивость к двум антибиотикам.
Представленные результаты показали, что рекомбинация между короткими гомологичными последовательностями может происходить в молекулах ДНК, разорвавшихся in vitro, что также было показано Chang и Cohen [42]. Они инактивировали ген Cm(r), содержащий сайт EcoRI, путем инсерции сегмента EcoRI в этот сайт. Инактивированый ген находился на репликоне , родственном ColE1 (p15), и введен в E.coli трансформацией. Cm(r)-трансформанты были получены в клетках, которые имели EcoRI рестрикционно/модификационную сис- тему, но не в клетках, которые ее утратили. Трансформанты содер- жали плазмиды, несущие интактный ген Cm(r), что говорит о том, что EcoRI-опосредованая выщепление инсерционного сегмента проис- ходит in vivo. Похожий результат наблюдался при трансформации E.coli плазмидой, сконструированой так, что выщепление одного сегмента EcoRI и инверсия другого требовались для получения гене- рации функционального гена Cm(r).
Рекомбинации, которым способствует разрезание EcoRI, происхо- дят не только во время трансформации, а также и в течение нор- мального роста бактерии. Размножение плазмид, несущих неактивный ген Cm(r) в клетках, которые имеют EcoRI ресрикционно/модификационную систему, происходит в результате появления производных, не- сущих функциональный ген Cm(r). Такие производные не появляются в клетках без этой системы. Только один класс рекомбинационных со- бытий, соединение способных к сцеплению концов, может быть зафик- сирован селекционной процедурой, использующейся в экспериментах с ДНК, разорванной in vivo [ 42 ]. В свете результатов, полученых с ДНК, разорванной in vitro, другие события, как рекомбинация между короткими гомологичными повторами, удаленными от концов, вероятно тоже происходят. Если так, то возможно, что большинство процес- сов, генерирующих двухцепочечные разломы in vivo, могут включать незаконную рекомбинацию.
Было предположено, что ферменты, расщепляющие промежуточные продукты гомологичной рекомбинации, могут случайно вводить реком- биногенетические двухцепочечные разломы в ДНК [ 59 ].Было показано, что два таких фермента, эндонуклеаза VII фага T4 и эндонуклеаза I фага T7, разрезают крестообразные структуры in vitro [ 61 , 62 , 141 , 194 ].
Взаимодействие палиндромов , которые часто соседствуют с конечными точками делеций [ 93 ], может приводить к возникновению крестов, которые могут быть разрезаны in vivo, и получающиеся двухцепочечные разломы могут инициировать незаконную рекомбинацию. Тем не менее, не существует свидетельства роли ферментов, разре- зающих кресты, в рекомбинации между короткими гомологичными последова тельностями. Так как выщепление Tn10 может происходить путем переключения матрицы [ 31 ], возможно, что предполагаемый разрез крестообразных структур не играет роли в этом рекомбинаци- онном событии.
Можно предположить, что различные ферменты, разрезающие и сшивающие ДНК, могут случайно генерировать либо двухцепочечные разломы, либо повреждения, превращаемые в них другими клеточными функциями, и, следовательно, включать незаконную рекомбинацию. Белок A фага Mu , необходимый для транспозиции , может играть ту же роль. Этот белок требуется для выщепления фага, что происходит при рекомбинации между короткими гомологичными последовательностями в окрестностях концов фага [ 204 ]. Предполагается, что такие события происходят вблизи двухцепочечных разломов.
Зашивание разломов - это обязательный шаг в любом рекомбина- ционном процессе, использующем разрыв ДНК. Следуя модели, пред- ставленной в начале подраздела, этот шаг должен соответствовать зашиванию надрезов в полностью репарированой рекомбинантной моле- куле. Могут быть и альтернативы. ДНК-лигаза может соединять нук- леотиды,кратковременно сведенные вместе, путем отжигания коротких одноцепочечных гомологичных последовательностей, и получающаяся молекула может дальше быть включена в зрелый рекомбинант .
Несколько линий экспериментов указывают,что лигаза может объ- единять нуклеотиды, которые совмещаются только на короткое время. (i) Когезивные концы сегментов ДНК, сгенерированые ферментами рестрикции могут быть соединены in vitro при температурах, превы- шающих температуру их плавления; (ii) хорошо известно, что объе- динение молекул с обрезанными концами, катализируемое лигазой T4 in vitro и in vivo в клетках E.coli [ 49 ], требует крат- ковременного совмещения несмежных нуклеотидов; и (iii) T4 лигаза- катализируемое объединение нуклеотидов, разделенных щелью, зафик- сированной in vitro [ 210 ], также требует кратковременного совме- щения несмежных нуклеотидов.
Для выяснения роли лигазы в рекомбинации между короткими пов- торами, клетки, которые либо продуцировали избыток лигазы (lop-11), либо имели уровень лигазы дикого типа, либо имели термочувствительную лигазу(lig-7) и короткое время были выдержаны при рестрикционной температуре, были трансформированы линейной плазмидной молекулой ДНК с обрезанными концами. Делеции происхо- дили с частотой 64, 33, и 4% среди трасформантов, полученых в lop-11, дикого типа и lig-7 клетках, соответственно. Аналогично, закольцовывание линейных молекул с концами, способными к сцепле- нию, было менее эффективно (в три раза) в lig-7 клетках и более эффективно (в три раза) в lop-11 клетках, чем в клетках дикого типа [ 47 ]. Кольцевые молекулы, имеющие надрез на каждой из двух нитей ДНК, трансформируют три типа клеток с одинаковой эффективностью. Все это указывает на то, что для формирования делеций требуется больше лигазы, чем для зашивания надреза, что позволя- ет предположить, что лигаза в рекомбинации между короткими гомо- логичными последовательностями не просто заделывает разрез в полностью отрепарированой молекуле, а, возможно, соединяет нуклео- тиды, которые совмещаются на короткое время.
