Ядерно-цитоплазматический транспорт: экспериментальные подходы
Для осмысления каких-либо научных данных часто необходимо понимать, каким образом эти данные были получены. Поскольку исследователи ядерно-цитоплазматического транспорта часто используют довольно необычные объекты и эксперименты, имеет смысл описать некоторые из них.
Во-первых, эксперименты проводятся на ооцитах Xenopus laevis. В эту огромную клетку ( рис. 11 ) микроинъецируют субстрат, после чего ядро отделяют от цитоплазмы, а накопление субстрата в той или иной фракции определяют по включению радиоактивной метки или, в последние годы, проводят иммунноблотинг. На ооцитах, например, была сделана пионерская работа, доказавшая независимость различных видов транспорта РНК ( Jarmolowski, A. et. al. 1994 ).
Второй тип экспериментов ставится на клеточных культурах, обработанных дигитонином . Это вещество повреждает внешнюю мембрану клетки, но оставляет интактной ядерную оболочку ( Adam et. al. 1990 ). Тем самым можно вымыть из такой клетки все цитоплазматические компоненты транспортных систем и исследовать транспорт различных субстратов, добавляя препараты белков, подозреваемых на функцию транспортинов для данных субстратов. Если, к примеру, флуоресцентный субстрат накапливается в ядре ( рис. 12 , верхняя половина), значит подозреваемый белок отвечает за его импорт. С другой стороны, можно истощать цитоплазматические экстракты тех же ооцитов Xenopus на разных адсорбентах и тестировать их после этого на возможность индуцировать транспорт тех же субстратов. Например, если истощение экстракта на никель-агарозе ингибирует импорт NLS-белков , значит, с данным адсорбентом связывается фактор, принимающий участие в этом процессе (так был найден импортин-альфа ) ( Gorlich et. al. 1994 ).
Еще один тип экспериментов производится на дрожжах с помощью молекулярно-генетических методов ( рис. 13 ). На этом объекте было получено большое количество сведений относительно строения ядерных пор и действия транспортинов. К сожалению, транспортные системы дрожжей довольно значительно отличаются от таковых многоклеточных.
Наконец, для исследования физико-химических свойств ядерных пор, используется целый спектр биофизических методов. Среди них можно упомянуть метод силовой атомной микроскопии (AFM; atomic force microscopy), позволяющий наблюдать состояние ядерной поры в растворе. Это позволяет исследовать действие различных факторов на диаметр ядерной поры и ее высоту ( рис. 14 ) ( Danker T., H. Oberleithner, 2000 ).
Еще один необычный биофизический метод - так называемый метод ядерных песочных (nuclear hourglass) часов. Этот метод позволяет определять электропроводимость ядерных пор для больших ядер более точно, чем метод с использованием микроэлектродов. Суть метода заключается в закреплении ядра в центре сосуда, имеющего форму песочных часов, и измерении сопротивления между верхним и нижним отделениями ( рис. 15 ) Danker T., H. Oberleithner, 2000 ).
