Фенилкетонурия: генотерапия
Примеры с тирозинемией и ADA геном показывают достаточно простую ситуацию, когда генная терапия имеет очень высокие шансы на успех и на то, чтобы стать заурядной клинической процедурой. Однако не всегда все так просто. Например, такая распространенная болезнь метаболизма, как фенилкетонурия, чаще всего вызывается дефеком единствернного гена фенилаланингидроксилазы . В результате фенилаланин не может превращаться в тирозин. Биологическим следствием этого дефекта являются многие клинические проявления болезни, в том числе и умственная отсталость, которые можно предотвратить специальной диетой. Поэтому всех детей проверяют при рождении на фенилкетонурию, чтобы во-время начать диетотерапию. Один ген, но фермент, кодируемый им, требует для своей активности кофакторы, которые синтезируются в печени, и поэтому, хотя на моделях и ведутся исследования потенциалов генной терапии в этом направлении, до практического ее использования еще, по-видимому, далеко.
Группа американских ученых под руководством Woo S. (Бэйлоровский медицинский коледж, Хьюстон, США) еще в 1985 году провела первые работы по встраиванию кДНК фенилаланингидроксилазы человека (клон phPAH 247) в эукариотический вектор, содержащий промотор и кеп-сайт гена металлотионина человека (MTII) ( Ledley F.D.,1985b ). Проведение анализа клеток мыши линии NIH 3T3, трансформированных рекомбинантным клоном MPAH(+), с помощью Southern, Nothern, Western блот-гибридизаций выявило стабильную интеграцию и экспрессию гена фенилаланингидроксилазы человека в клетках мыши. В клеточном экстракте трансформированных клеток была зарегистрировала птеринзавиcимая активность фенилаланингидроксилазы. В последующих своих работах авторы использовали для переноса гена ФАГ в качестве векторов ретровирусы.
3'Нетранслируемая область кДНК, включая сигнал полиаденилиpoвания, была делетирована с помощью рестриктазы Hind III. Область кДНК, соответствующая 1-1899 парам оснований, была субклонирована в Bam HI сайт ретровирусного вектора p ZIP-NEO SV (X), содержащий бактериальный "neo" ген. Данный дефектный ретровирус лишен генов gag, pol и env и, следовательно, не может осуществлять вирусную пролиферацию. Однако он сохраняет способность инфицировать широкий круг клеток и стабильно интегрировать провирусную ДНК в клеточный геном. Полученный авторами рекомбинантный ретровирус pZPAH (+) содержал ген ФАГ человека, фланкированный с обеих сторон 5' и 3' длинными концевыми повторами (LTR), а также участок нуклеотидной последовательности (E) для упаковки в капсид и ген neo ( Ledley F.D.,1986 ).
Для наработки гибридных ретровирусов использовали комплементирующую линию клеток 2. Такая линия клеток содержит мутантную провирусную ДНК вируса лейкемии мышей Moloney (Mo-MLV) с делетированным участком нуклеотидной последовательности, необходимым для упаковки вирусной РНК в капсид. В результате этого ДНК Mo-MLV не инфекционна, однако в трансформированных клетках она направляет синтез белковых продуктов генов gag, pol и env, которые она содержит. Вводимая в такие клетки дефектная гибридная провирусная ДНК дает начало вирусному потомству, содержащему чужеродные гены.
Линию клеток 2 трансформировали кальций-фосфатным методом гибридным вектором pZPAH(+) для получения ретровирусов, несу щих ген фенилаланингидроксилазы человека. Стабильные трансформанты, содержащие интегрированную ДНК с селективным маркером "neo" скринировали на среде с антибиотиком геноцитином (G-418). В результате этих экспериментов было показано образование в клетках 2 гибридных ретровирусов, способных эффективно трансдуцировать ген фенилаланингидроксилазы (ген ФАГ) человека. Супернатантом этих клеток инфицировали клетки фибробластов мыши линии NIH 3T3 и клетки гепатомы мыши hepa 1-a (HPRT-). Рекомбинатные клоны клеток линии NIH 3T3 выявляли на среде с антибиотитком G-418, а клетки hepa-1a на среде с 6-тиогуанином.
С помощью Southern и Nothern блот-гибридизаций в геноме трансформированных клеток была выявлена стабильная интеграция и эффективная транскрипция гена ФАГ человека. Данные иммуноблоттинга со спефической в отношении ФАГ антисывороткой выявили наличие иммунореактивного протеина - ФАГ. В клетках NIH 3T3, трансформированных pZPAH(+), была зарегистрирована птерин-зависимая активность ФАГ, которая достигала 15 - 75% от активности ФАГ в клетках гепатомы человека линии hep G-2. Клеточные экстракты клеток гепатомы мыши hepa-1a, трансформированные pZPAH(+), обладали ферментативной активностью ФАГ, зарегистрированной in situ по способности перевода [14С] фенилаланина в [14С] тирозин.
В следующей работе авторы использовали рекомбинантный ретровирус, содержащий кДНК ФАГ человека под контролем промотора re- на альфа-1 антитрипсина человека ( Peng H.,1988 ). Данный промотор обладает высокой тканеспецифической экспрессией в клетках печени.
При создании рекомбинантного ретровируса авторы первоначально использовали фрагмент Smal-EcoRl кДНК phPAH247, содержащий 213- 2453 пары оснований, клонировали в Hind III сайт вектора pA10 CAT2. Вектор содержит TATA бокс и инициирующий сайт раннего промотора вируса SV 40, а также промотор гена альфа-1 - антитрипсина че ловека, т.е. Ava l - Bam H I фрагмент из 700 пар оснований. Этот фрагмент гена альфа-1 - антитрипсина в цисположении придает генам высокую тканеспецифическую экспрессию в клетках печени. Затем фрагмент размером 2 килобазы, содержащий гибридный промотор а1 AT/SV40 и кДНК ФАГ, был вырезан рестриктазой Sal I- Hpa I и встроен в Xho I сайт ретровируса N2. Ретровирус N2 содержит длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкемии мышей Moloney, участок Е, необходимый для упаковки в капсид, включая 5'конец gag области, а также Tn5 неомицин резистентный ген. Созданный рекомбинантный ретровирус авторы обозначали pNAS-hPAH.
В своей работе авторы исследовали транскрипцию мРНК гена ФАГ человека в клетках фибробластов мыши линии PA317 и первичной культуре гепатоцитов мыши. Результаты Northern гибридизации показали, что в клетках фибробастов мыши происходит транскрипция полноразмерной провирусной мРНК с длинных концевых повторов (LTR). Небольшое количество мРНК транскрибируется с внутреннего химерного промотора а1 AT/SV40. В гепатоцитах высокий уровень транскрипции происходит как с LTR, так и с внутреннего гибридного промотора а1 AT/SV40. Уровень экспрессии гена ФАГ человека в последнем случае сравним с конституитивным синтезом мРНК в клетках печени человека.
Проведенная экспериментальная работа явилась важным шагом на пути к генной заместительной терапии. Можно полагать, что кроме диетотерапии возможен альтернативный- генотерапевтический - путь лечения фенилкетонурии. Полученнные у больных фенилкетонурией клетки печени (гепатоциты) пункцией с последующим их инфицированием рекомбинантными ретровирусами, содержащими полноценный ген ФАГ, и последующей их реинплантацией будут способствовать устранению дефекта фенилаланингидроксилазной активности клеток печени.
В центре исследовательских работ по генной терапии проводятся работы по созданию прямых систем по доставке ДНК в нужные ткани органов (например, печени), основанные на использовании ДНК-протеиновых комплексов. Для повышения эффективности переноса этих комплексов используют аденовирусы с дефектной системой репликации, осуществляющие эндосомальный лизис. Проведены модельные работы по соматической генотерапии фенилкетонурии на мышах, основанные на комбинации этих методов ( Fang B.,1993 ; Cristiano R.J.,1993 ). Исследовательские работы выполнены как на гепатоцитах мыши линии PAH- in vitro ( Cristiano R.J.,1993 ), так и in vivo на мышах линии Pahenu2, имитирующих больных фенилкетонурией ( Fang B.,1993 ). У подопытных мышей через 5 дней полностью восстанавливалась активность фенилаланингидроксилазы и нормализовался уровень фенилаланина в сыворотке крови в результате проникновения и экспрессии чужеродной ДНК в гепатоцитах мыши ( Fang B.,1993 ).
На этот метод по корректировке генетических болезней обмена веществ, в частности фенилкетонурии, возлагаются большие надежды, т.к. метод не требует хирургических вмешательств.
