Тирозинемия I типа: генотерапия
Развивается направление исправления наследственных дефектов человека методами генной терапии. В 1995 году опубликована работа по переносу гена фумарилацетоацетат гидролазы человека в фибробласты больных тирозинемией I типа (дефект в гене фумарилацетоацетат гидролазы, FAH ).
. В качестве вектора была сконструирована ретровирусная плазмида pHFAH HA2 с удаленным фрагментом в 45 bp, содержащего канонический поли-A конец (Phaneuf D.,1991 ). Делетированный фрагмент был заменен Bgl II линкером. Полная кодирующая последовательность кДНК FAH, вырезанная рестриктазами Bam HI и Bgl II, была субклонирована в плазмиду pLXSN путем инсерции в сайт Bam Hl. Таким образом был сконструирован ретровирусный вектор pLFAHSN, в котором кДНК FAH транскрибируется под контролем 5' длинных концевых повторов (LTR). Ретровирусная плазмида содержала "neo" кассету с промотором SV 40, кодирующую неомицинфосфотрансферазу. Такая конструкция позволяла проводить селекцию клеток, резистентных к аналогу неомицина G418. Первичные фибробласты, полученные путем кожной биопсии от больных тирозинемией I типа, были инфицированы рекомбинантной ретровирусной плазмидой. В трансформированных фибробластах было зарегистрировано присутствие FAH протеина с помощью Western блоттинга и анти-FAH антител. Активность FAH была повышена в 25-30 раз по сравнению с нетрансформированными фибробластами. Экспрессия FAH регистрировалась в течение 6 месяцев.
Ретровирусные векторы широко используются в протоколах генной терапии, т.к. стабильно интегрируемый трансген эффективно экспрессируется в реципиентных клетках.
В 1996 году в модельных опытах на мышах продемонстрировано эффективное применение генной терапии на печени, которое может быть использовано и в отношении больных тирозинемией I типа. В гепатоциты FAH(-) мышей был трансдуцирован ген FAH путем ретровирусной инфекции. Отобранные рекомбинатные FAH(+) гепатоциты были инъецированы в печень мышей с тирозинемий. Как показали исследования, у этих мышей полностью восстанавливалась FAH активность в печени ( Overturf K.,1996 ).
Была также создана трансгенная мышь с нокаутированным геном, кодирующим фумарилацетоацетат гидролазу. Гомозиготные нокаутированные мыши погибали на 12 день после рождения. Они хорошо моделировали наиболее острую форму НТ1. Мышь подвергали лечению лекарством, которое уменьшает гепатотоксичность у больных НТ1. Это лекарство спасало мышей от совсем уж ранней смерти. Правда, затем у них развивалась гепатоцеллюларная карцинома , абсолютгно похожая на соответствующую карциному у пациентов, страдающих от НТ1. Была высказана гипотеза (она основана на определенных наблюдениях клиницистов), что гепатоциты, в которых будет экспрессироваться нормальный фермент FAH, должны иметь преимущества в скорости роста по сравнению с гепатоцитами, в которых этот ген не функционирует. Действительно, трансплантация больной нокаутированной мыши всего 1000 гепатоцитов, взятых от конгенной мыши, экспрессирующей нормальный фермент, приводила к потрясающему результату: в печени этой больной появлялось громадное количество нормальных гепатоцитов. (Конгенная мышь, congenic по-английски, это мышь, отличающаяся от данной мыши только в области гена, кодирующего FAH. Вот она ценность мыши! Попробуйте найти конгенных людей.).
И когда ей вводили в воротную вену гепатоциты, трансформированные ретровирусом, содержащим здоровый ген, результат был аналогичным. В результате больное животное приобретало нормальную функцию печени и спокойно выживало без обработки лекарством, упомянутым выше. Это очень важный результат. Он показывает нам некую общую идею: как важно было бы обеспечивать селективные преимущетсва клеткам, которые несут здоровый ген, после генно-инженерных манипуляций. Тогда они могут постепенно вытеснять немодифицированные больные клетки и стоновятся хозяевами положения, давая больному тот продукт, от отсутствия которого он страдает. Такие селективные преимущества можно заранее предусматривать, вводя, наряду с геном исцелителем, гены, специально предназначенные для придания трансформированным клеткам селективных преимуществ. Например, при генной терапии рака пытаются вводить для этих целей гены множественной устойчивости к лекарствам (MDR) в клетки костного мозга.
