E1 альфа-Ген BCKDH комплекса
Ген E1 альфа субъединицы дегидрогеназы кетокислот с разветвленной цепью
В 1988 году была клонирована кДНК человека гена E1 альфа субъединицы дегидрогеназы кетокислот с разветвленной цепью комплекса BCKDHC (branched chain a-keto acid dehydrogenase complex) (Zhang B.,1988 ). кДНК размером 1552 пар оснований была выделена из библиотеки кДНК печени человека. Данная кДНК содержала открытую рамку считывания длиною 1134 пар оснований, кодирующую 378 аминокислот, и 3'нетранслируемую последовательность из 418 пар оснований. При сравнении выделенной кДНК человека с ранее выделенной кДНК крысы ( Zhang B.,1987 ) выяснилось, что выделенный клон кДНК человека не содержит 24 триплета, кодирующих аминокислоты с N конца, а также последовательность, кодирующую лидерный пептид (leader peptide). На основе нуклеотидной последовательности кДНК человека была выведена аминокислотная последовательность Е1 альфа субъединицы дегидрогеназы кетокислот с разветвленной цепью. В этой же работе было показано, что размер мРНК E1 альфа субъединицы дегидрогеназы кетокислот с разветвленной цепью равен 1,8 kb.
В 1989 году Fisher ( Fisher C.W.,1989 ) проклонировал полную нуклеотидную последовательность кДНК E1aльфа субъединицы дегидрогеназы человека. Выделенный клон кДНК состоял из 1783 пар оснований, кодирующих 400 аминокислотных остатков.
В 1991 году был клонирован ген E1альфа субъединицы дегидрогеназы кетокислот с разветвленной цепью человека ( Dariush N.,1991 ). Однако в данной работе выделенный клон, также как и в предыдущей работе, не содержал 5'нетранслируемую область гена. Нуклеотидная последовательность 5'конца гена была проклонирована и более полно охарактеризована в работах McKean M.C. и Chuang J.L ( McKean M.C.,1992 ; Chuang J.L.,1993 ).
Ген E1 альфа субъединицы дегидрогеназы протяженностью около 55 килобаз состоит из 9 экзонов. В Таблице 25 представлены экзон-интронные сочленения этого гена. Девять экзонов гена кодируют аминокислотную последовательность пре-E1 альфа субъединицы из 445 аминокислотных остатков. На Рис. 19 показаны нуклеотидная (мРНК) и аминокислотная последовательности Е1 альфа суъединицы дегидрогеназы.
Экзон 1 (135 bp) содержит три инициирующих сайта транскрипции в положениях +1, +18, +22 (на Рис. 19a эти сайты обозначены *). Секвенирование 5'фланкирующей области гена показало отсутствие канонических TATA боксов. В 5'области выявляются множественные копии CAAT боксов в положениях от -196 до - 205 и от -377 до -369, а также три SP1 связывающих сайта (GGGCGG) в позициях нуклеотидов от -320 до -325, от -864 до -859, от -1290 до -1295; три AP2 связывающих сайта (CCCCAGGC) в положениях нуклеотидов от +149 до +156 (интрон 1), от +115 до +122 (экзон 1) и от -228 до -235. В 5'области выявляются также три FSE-1 элемента в положениях от -214 до -203, от -294 до -283, и от -392 до -404; две копии FSE-2 элемента в положениях от +189 до +202 (интрон 1) и от -116 до -127. В 5' области выявляются также множественные копии GRE и cAMP ( CRE ) элементов, а также многие копии прямых (DR) и инвертированных (IR) повторов . С помощью делеционного анализа были выявлены промоторные области гена в позиции нуклеотидов от -320 до -115 в случае экспресии гена в клетках человека Hep-G2 и в позиции от -115 до -909 в случае транскрипции гена в клетках хомяка CHO, что, вероятно, отражает специфическую дифференциацию промоторной функции гена относительно видовой принадлежности клеток. В положении выше нуклеотида (- 320) находится ингибитор промоторной активности гена. На Рис. 19a представлена 5'фланкирующая область гена.
Клонированы также кДНК E1aльфа субъединицы дегидрогеназы кетокислот с разветвленной цепью крысы ( Zhang B.,1987 ), быка ( Hu C.W.C.,1988 ), на основе которых выведены аминокислотные последовательности.
