Ген фенилаланингидроксилазы
Gene: 12q241/PAH] phenylalanine hydroxylase; phenylketonuria
Ген фенилаланингидроксилазы (ФАГ) человека локализован на длинном плече 12 хромосомы в сегменте 12q22 - 12q24.1 ( Lidsky A.S.,1984 ; Lidsky A.S.,1985 ).
Первым этапом в изучении данного гена было выделение мРНК из полисом печени крысы с последующим клонированием кДНК ( Robson K.J.H.,1982 ). Позднее методами гибридизации, используя в качестве зонда кДНК гена ФАГ крысы, из библиотеки кДНК печени человека были получены клоны, содержащие ген ФАГ человека ( Woo S.L.C.,1983 ). После выделения полноразмерной копии кДНК гена ФАГ человека, размером 2448 пар нуклеотидов, была секвенирована кодирующая часть гена, на основе которой выведена аминокислотная последовательность пептида из 451 аминокислотного остатка с молекулярным весом 51672 дальтон ( Kwok S.C.M.,1985 ).
Впоследствии была создана космидная библиотека гена ФАГ человека, что позволило определить его структурную организацию ( DiLella A.G.,1986 ). Кодирующая часть гена состоит из 1353 нуклеотидов. Было показано, что открытая рамка считывания начинается инициирующим кодоном ATG в положении 223 и заканчивается TAA кодоном в положении 1579. 5'нетранслируемая область, протяженностью из 200 нуклеотидов, в положении 105-114 содержит олигонуклеотидную последовательноcть UCGUUACCGC, частично гомологичную 3'концу 18S рРНК ( Hagenbuchle O.,1978 ; Kwok S.C.M.,1985 ). Предполагалось, что по аналогии с обнаруженными закономерностями у прокариот, такая гомологичность между 5' концом мРНК и 3' рРНК играет роль в формировании стабильности комплекса при трансляции.
Однако впоследствии выяснилось, что 5'-концевая часть нукеотидной последовательности кДНК размером в 164 нуклеотида являтся артефактом, возникшим в результате клонирования. В 1992 году была опубликована уточненная нуклеотидная последовательность 5'- конца гена ФАГ человека ( Konecki D.S.,1992 ), на основе которой произведена характеристика структуры данной области гена. Инициирующий сайт транскрипции (CAP) расположен на расстоянии 154 нуклеотидов от первого кодона трансляции. Последовательность из 319 нуклеотидов, лежащая перед CAP-сайтом, характеризуется утерей TATA-бокса и наличием последовательностей из GC-боксов, CACCC-боксов, CCAAT-боксов, протеиновыми сайтами активации (PAH-A, PAH-B), элементами связывания глюкокортикоидов ( Gre ) и циклического АМФ. 5'- Фланкирующая область гена ФАГ содержит множественные cis-элементы с позитивной и негативной активностью для направления тканеспецифической экспресии ( Wang T.,1994 ). На рис. 3 представлена 5'-фланкирующая область, кодирующая часть гена ФАГ человека, и соответствующая ей аминокислотная последовательность.
3'нетранслируемая область, протяженностью из 851 нуклеоида, несет несколько терминирующих кодонов для всех рамок счиывания. Перед сайтом полиаденилирования , состоящим из 19 аденинов, на расстоянии 13 нуклеотидов находится участок, содержащий 3 гексануклеотидные последовательности ААТААА в положениях 2198, 2347 и 2413. Полагают, что эти последовательности играют роль в процессинге и полиаденилировании мРНК ( Proudfoot N.J.,1976 ; Kwok S.C.M.,1985 ). На расстоянии 9 нуклеотидов после сайта полиаденилирования расположен мотив CACTG , идентифицированный и в других генах эукариот, также играющий роль в процессинге и полиаденилировании ( Birnstiel M.L.,1985 ; DiLella A.G.,1986 ).
Ген ФАГ включает в свой состав 13 экзонов, протяженностью 90000 пар оснований ( DiLella A.G.,1986 ). Протяженность экзонов колеблется от 57 пар нуклеотидов (9-ый экзон) до 892 нуклеотидов (13-ый экзон). Ген высокоинтронирован, размер интронов варьирует от 1000 пар нуклеотидов (7-ой интрон) до 23500 пар нуклеотидов (3-й интрон). Если на долю кодирующей части гена приходится 2400 пар нуклеотидов, то интроны состоят из 85000 нуклеотидов. Отношение кодирующей части к некодирующей части ДНК гена ФАГ самое низкое среди изученных эукариотических генов.
Анализ экзон-интронных пограничных сочленений показывает, что интроны начинаются с канонического динуклеотида GT и заканчиваются каноническим динуклеотидом AG ( DiLella A.G.,1986 ). Три типа экзон-интронных пограничных сочленений прослеживается в гене. Тип "0" - интрон локализуется между двумя кодирующими триплетами (1,2,4,8,9 и 10 интроны), тип"I" - между первым и вторым нуклеотидами кодирующего триплета (3,6 и 12 интроны), тип "IIl" - между вторым и третьим нуклеотидами кодирующего триплета (5,7 и 11 интроны). На рис. 4 представлены экзонинтронные сочленения в гене ФАГ человека.
Активный центр фермента образован карбоксильным концом пептида, содержащим последние 305 аминокислот, т.е. со 148 по 451 аминокислоту ( Ledley F.D.,1985a ; Iwaki M.,1986 ). Данная область кодируется локусом гена, локализованным в 6 - 13 экзонах. N-конец фенилаланингидроксилазы представляет собой домен субстратной специфичности ( Ledley F.D.,1985a ; Iwaki M.,1986 ). Особый интерес представляет вопрос о связи структуры гена и ее изменений с активностью молекулы фермента.
