Hsp104 Шаперон: поддержание детерминанта [PSI+] и других прионов
Что является единицей наследования [PSI+] и каким образом наследуются агрегаты [PSI+]? На наследование этого детерминанта влияют шапероны семейств Hsp70 и Hsp40 (обзор Jones and Tuite, 2005 ), однако для поддержания [PSI+] ( Chernoff et al., 1995 ) и других прионов дрожжей ( Derkatch et al., 1997 ; Moriyama et al., 2000 ) самая важная роль принадлежит Hsp104.
Дрожжевой белок Hsp104 является шапероном из семейства Нsp100 . Он и его бактериальный ортолог ClpB необходимы для выживания клеток в условиях экстремальных стрессов, например, при повышенной температуре или высоком содержании этанола в среде. Показано, что поддержание [PSI+] клетками дрожжей зависит от экспрессии Hsp104. Делеция гена HSP104 , кодирующего этот белок, приводит к исчезновению детерминанта [PSI+], его сверхэкспрессия ослабляет супрессорный фенотип, вызванный [PSI+] (связанный с супрессией нонсенс-мутации), и часто вызывает потерю этого детерминанта ( Chernoff et al., 1995 ). При потере мультикопийной плазмиды, кодирующей ген HSP104, супрессорный фенотип восстанавливается, из чего был сделан вывод о том, что для поддержания [PSI+] необходим "средний" уровень HSP104.
Hsp104 разбирает большие агрегаты денатурированных белков до агрегатов меньших размеров, что позволяет шаперонам Hsp70 и Hsp40 подвергнуть их дальшейшему пересворачиванию и солюбилизации ( Parsell et al., 1994 ; Glover and Lindquist, 1998 ).
Подобное действие Hsp104 на филаментные прионные частицы должно иметь существенно иной эффект. Каждый акт дробления филамента увеличивает эффективность прионной конверсии, поскольку образуются новые полимеры, обладающие дополнительными концами для полимеризации. Происходит увеличение количества прионных частиц, необходимых для стабильного наследования приона ( Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998 ). Фактически, фрагментация завершает цикл репликации приона. Другая часть цикла представляет собой рост прионной фибриллы за счет полимеризации, которая не требует, по крайней мере in vitro, дополнительных факторов. Согласно этой модели делеция гена HSP104 приводит к потере детерминанта из-за прекращения дробления агрегатов и возникновению в клетке одного крупного агрегата вместо многих мелких "семян". При делении клетки этот агрегат останется только в одной из двух образовавшихся клеток, а вторая, естественно, освободится от прионного Sup35 (следовательно и от [PSI+]). Это рассуждение опирается на то, что весь прионный белок в клетке находится в виде нерастворимых агрегатов, что впрочем, косвенно подтверждается многими экспериментальными фактами ( Paushkin et al, 1996 ; Patino etal, 1996 ).
Сформулирована альтернативная модель функции Hsp104, по которой Hsp104 усиливает прионную конверсию, помогая прионогенному белку приобрести некую промежуточную нефолдированную конформацию ( Patino et al., 1996 ; Serio et al., 2000 ). Было показано, что добавление Hsp104 в низкой концентрации устраняет лаг-фазу образования фибрилл и увеличивает скорость полимеризации Sup35NM in vitro ( Shorter and Lindquist, 2004 ).
Вместе с этим продемонстрировано in vitro, что Hsp104 не требуется для прионного перехода Sup35 ( Glover et al., 1997 ). Кроме того, изучение ингибирования Hsp104 говорит о том, что первая модель наиболее вероятна. Активность Hsp104 может быть ингибирована добавлением низких концентраций GuHCl к растущей культуре клеток дрожжей ( Ferreira et al., 2001 ). Считается, что этот агент блокирует один из двух нуклеотид-связывающих доменов шаперона Hsp104, что нарушает его АТФ-азную функцию и приводит к потере приона ( Ferreira et al., 2001 ). Известно, что такая обработка дрожжевых клеток приводит в потере [PSI+] ( Tuite et al., 1981 ) и других прионов. Изучение кинетики потери [PSI+] в присутствии GuHCl приводит к заключению, что он блокирует размножение прионных "семян" (единиц наследования), не затрагивая процесс включения мономеров в прионные полимеры ( Ness et al., 2002 ). Если прионные "семена" не реплицируются, то деление культуры клеток сопровождается постепенным уменьшением их количества в каждой клетке ( Eaglestone et al., 2000 ).
Аналогичные результаты были получены при использовании метода SDD-AGE ( Kryndushkin et al., 2003 ). Добавление GuHCl в среду приводило к быстрому увеличению среднего размера прионных полимеров, без нарушения процесса полимеризации Sup35, по крайней мере, в первом поколении клеток. Размер полимеров Sup35 возрастал в два раза на каждое клеточное поколение, что возможно только при полном блоке их фрагментации и полном включении вновь синтезированного Sup35 в полимеры.
Полученные данные свидетельствуют в пользу модели фрагментации Hsp104 прионных полимеров, чем достигается стабильность их наследования. Таким образом, поддержание приона в клетке можно представить как совокупность двух процессов - полимеризации (перехода мономеров в полимерную форму) и фрагментации (дробления полимеров на более мелкие).
