Структура и функция белка Sup35
Белок Sup35, GTP-зависимый фактор терминации трансляции дрожжей, состоит из трех доменов - N, M и C ( Kushnirov et al., 1988 ), представляющих собой отдельные функциональные блоки ( рис. 3 ) ( Ter-Avanesyan et al., 1993 ; Ter-Avanesyan et al., 1994 ).
С-концевой домен (С, последние 254-680 а.к.) эволюционно консервативен, структурно сходен с фактором элонгации трансляции EF-1альфа и выполняет функцию фактора терминации трансляции eRF3 . Включение белка Sup35 в состав фибриллы препятствует его функции терминации трансляции.
N-концевая область несущественна для жизнеспособности и может быть подразделена на собственно N-концевой домен (N, первые 123 а.к.), необходимый для возникновения и поддержания фенотипа [PSI+] , но не важный для терминации трансляции, и средний домен М (124-253 а.к.), не являющийся существенным ни для трансляции, ни для прионообразования ( Ter-Avanesyan et al., 1993 ).
N- и M-домены отличаются друг от друга по аминокислотному составу и типу вторичной структуры.
Аминокислотный состав N-домена довольно необычен - 27% Gln, 18% Asn, 17% Tyr, 17% Gly, - и он почти не имеет заряда. Такая последовательность способна формировать вторичную структуру, богатую бета-слоями. Полярные глутамин и аспарагин (вместе 45%) стабилизируют бета-слои многочисленными водородными связями ( Perutz et al. 1994 ). Глицин - аминокислота с небольшим радикалом, позволяет аминокислотной цепи свободно изгибаться, и, возможно, помогает фибрилле легче сворачиваться ( Alberts et al. 2002 ). Тирозин - аминокислота, проявляющая существенные гидрофобные свойства. Частичная или полная делеция N-домена приводит к утрате детерминанта [PSI+] . Сверхэкспрессия N-домена, наоборот, вызывает появление [PSI+]. Все это говорит о том, что именно N-домен определяет прионные свойства Sup35.
N-домен принято делить на две области: NQ - область, содержащую наибольшее количество глутаминов и NR-область(R - от слова repeat), содержащую консенсусный олигопептид PQGGYQQ(Q)YN, который повторяется 6 раз. Возможно, область NQ ответственна за полимеризацию прионного полимера (присоединение мономера к растущему полимеру), а область NR нужна для наследования прионных полимеров ( Osherovich et al, 2004 ).
Домен М богат заряженными аминокислотами - Lys и Glu - вместе составляющими около 35%. Почти на всей его длине предсказывается aльфа- спиральная структура. Функция M домена Sup35 еще точно не выяснена. Вероятнее всего этот домен играет роль спейсера между двумя значимыми N- и С- доменами ( Тер-Аванесян с соавт., 1998 ); известно также, что М домен обуславливает растворимость и стабильность наследования [Psi+] ( Liu et al. 2002 ), и необходим для передачи конформационного варианта ( Bradley, Liebman 2004 ).
Белок Sup35 также известен как фактор eRF3 , отвечающий за терминацию трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и именно этой его функцией определяется фенотип детерминанта [PSI+] ( Stansfield et al, 1995 ).
Высокая консервативность функционального С-домена белка позволяет предполагать, что он выполняет подобную функцию и в других организмах ( Frolova et al, 1994 ). N-концевая часть белка Sup35 не обладает эволюционной консервативностью последовательности. Ген SUP35 имеет средний уровень экспрессии на протяжении всего жизненного цикла дрожжевой клетки.
Роль Sup35 не сводится только к процессу трансляции, показано его участие и в других независимых клеточных процессах. Например, в формировании актинового цитоскелета : репрессия гена SUP35 приводит к деполимеризации актина, нарушению формирования веретена деления и вследствие этого - дефектам цито- и кариокинеза ( Valouev et al., 2002 ). Показано также взаимодействие N-домена Sup35 с C-C-доменом белка Sla1 , участника формирования актиновых микрофиламентов ( Bailleul et al., 1999 ). Интересно, что частота возникновения [PSI+] de novo уменьшается в клетках, несущих мутации генов актинового цитоскелета. Кроме того, продемонстрирована ассоцииация агрегатов Sup35 с компонентами системы эндоцитоза и вакуолярного транспорта ( Ganusova et al, 2006 ). До этого было продемонстрировано наличие в составе актиновых пэтчей агрегатов прионного белка Rnq1 , а также амилоидного белка хантингтина , содержащего 103 остатка глутамина - Htt(Q103) , в комплексе c актиновыми пэтчами ( Meriin et al, 2003 ).
Большая часть результатов по динамике и кинетике полимеризации прионов была исходно получена с использованием укороченного Sup35, лишенного С домена (NM). При сверхэкспрессии NM фенотип [Psi+] возникает de novo чаще, чем при использовании полноразмерного Sup35. In vitro до недавних пор не удавалось получить полимеров Sup35. Cчиталось, что С домен затрудняет полимеризацию. Однако выяснилось, что затрудненная полимеризация, по крайней мере отчасти, связана с неспецифической агрегацией GTP-связывающих доменов Sup35. При насыщении GTP полноразмерный Sup35 способен к полимеризации in vitro ( Shorter, Lindquist. 2006 ). Фибриллы и агрегаты, самопроизвольно образуемые NM и полным Sup35 in vitro, очень близки по свойствам к тем, которые образуются в дрожжевых клетках ( Glover et al. 1997 ).
Cпособность С домена к терминации трансляции используется в качестве репортера [Psi] состояния ( Cox 1965 ). Если имеется много свободного мономера Sup35, терминация трансляции происходит эффективно. Использование дрожжевых линий с нонсенс мутацией в гене метаболизма аденина (Ade-) при эффективной терминации приводит к его неполному прочтению и инактивации. При этом накапливается окисленный продукт, который окрашивает колонии в красный цвет при культивировании на среде YPD. Такие клетки не могут расти на среде без аденина. Если же свободного мономера мало (он находится в агрегированной форме), то эффективной терминации не происходит, и ген прочитывается полностью (супрессия нонсенс мутации). Такие колонии окрашены в белый цвет и могут расти на среде без аденина (Ade+).
