Первичный отбор комплементарного матрице dNTP
Первичный отбор комплементарного матрице dNTP проходит в общем одинаково для разных ДНК-полимераз, хотя ряд параметров реакции влияет на этот процесс. Среди этих параметров в первую очередь следует назвать функциональное назначение конкретного процесса биосинтеза ДНК. Отбор комплементарного матрице dNTP начинается с образования канонических Уотсон-Криковских пар. Образование таких пар, во-первых, энергетически более выгодно, так как образуются водородные связи, оптимальные по сравнению с другими возможными вариантами. Во-вторых, правильно образованный комплекс вызывает конформационное изменение ДНК-полимеразы, что значительно ускоряет реакцию элонгации [ Brautigan ea 1998 , Doublie ea 1998 ] и последующую транслокацию фермента. При образовании неправильной пары энергетика и особенно кинетика процесса резко ухудшаются. Тем не менее, как показано экспериментально, ошибочные пары все-таки возникают с частотой от 10-4# до 10-6# для разных ДНК-полимераз. Причина их образования лежит в особенности процесса, катализируемого этими ферментами. Главная причина состоит в том, что ДНК-полимеразы на каждом шагу элонгации дДНК выбирают один из четырех различных по структуре dNTP, да еще в условиях, когда матричный нуклеотидный остаток в образующейся паре также вариабелен из-за соседних нуклеотидных остатков, влияющих на конформацию односпирального участка матрицы в активном центре. Кроме того, если все ДНК-зависимые ДНК- полимеразы используют в качестве матрицы ДНК, в результате чего сразу же образуется двухспиральный дуплекс в В-форме [ Saenger ea 1984 ], то в случае РНК- зависимых обратных транскриптаз на первом этапе при обратной транскрипции образуется смешанный комплекс ДНК-РНК, существующий в форме А [ Saenger ea 1984 ], а на втором этапе при репликации образуется комплекс ДНК-ДНК уже в форме В . Такая особенность требует от обратных транскриптаз существенно более высокой конформационной подвижности и, как следствие, компенсируется меньшей точностью. Поэтому, для ДНК-зависимых ДНК- полимераз ошибочные включения возникают в среднем с частотой 10-6#, а для обратных транскриптаз эта величина составляет 10-4# [ Takeuchi ea 1988 , Bebenek ea 1989 ].
