Хромосома X: неравная инактивация хромосомы, методы исследования
При изучении сдвига Х-инактивации для Х-сцепленных болезней возникают два основных методических вопроса: как сильно варьирует сдвиг Х-инактивации, определенный различными методами (отражают ли они реальное соотношение активности родительских хромосом X), и какой процент индивидуумов со значительным сдвигом X-инактивации наблюдается в норме среди женщин без проявления наследственной патологии и не имеющих близких родственников с генетическими аномалиями? В этой связи становятся актуальными особенности методов исследования особенностей X-инактивации и данные о частоте женщин с неравной Х-инактивацией в общей популяции.
Такая особенность неактивной хромосомы X, как поздняя репликация в S фазе, позволяет отличить ее от активной хромосомы с помощью метода дифференциального окрашивания хромосом ( Takagi, Oshimura, 1973 ). В связи с этим, при условии структурной аномалии одной из хромосом можно определить сдвиг инактивации ( Zabel et al., 1978 ). Данный подход к определению особенностей Х-инактивации является вполне информативным, но из-за эксклюзивности наличия структурных отличий хромосом X в женском кариотипе, использование данного метода затруднено.
В настоящее время для исследования особенностей Х-инактивации используются преимущественно молекулярно-генетические методы. Они основаны на использовании такой особенности неактивной хромосомы X как метилирование цитозина CpG динуклеотидов в 5'-положении. Подобный анализ состоит из двух стадий: первая - обработка геномной ДНК метилчувствительной рестриктазой, вторая - количественная ПЦР или гибридизация по Саузерну. До 1992г наиболее распространенным методом определения сдвига Х-инактивации являлось определение статуса метилирования 5'-участков гена HPRT и гена PGK , а также локуса М27р хромосомы X. В данных участках имеются сайты метилчувствительных ферментов HpaII или HhaI, фланкирующие полиморфные участки. Изучая особенности метилирования этих сайтов, становится возможным определение особенностей Х-инактивации. Таким образом, используя рестрикцию с последующей гибридизацией по Саузерну, определяется количественное соотношение метилированных участков отцовской и материнской хромосомы X ( Singer-Sam et al., 1990 ). Среди преимуществ данных методик одним из основных является высокая степень гетерозиготности изучаемых участков (HPRT - 18%, PGK - 30%, М27Р -88%) ( Allen et al., 1992 ; Camus et al., 1996 ). Эффективность сочетания данных методов варьирует от 30 до 80% ( Allen et al., 1992 ).
Из недостатков следует отметить необходимость работы с радиоактивной меткой при гибридизации по Саузерну и вероятность того, что рестрикция может пройти неполностью.
В 1992г был предложен метод определения сдвига Х-инактивации с помощью метилчувствительной рестрикции двух HpaII и HhaI сайтов в интроне 1 гена андрогенного рецептора (HUMARA) , подверженного Х-инактивации и локализованного в участке Xq13, и последующим количественным ПЦР анализом участка размером около 280 п.н., состоящим из консервативной последовательности с HpaII и HhaI сайтами и полиморфной последовательности (ЦАГ)n повторов ( Allen et al., 1992 ). На рисунке 4 представлено схематическое изображение последовательности интрона 1 гена HUMARA , используемой при изучении особенностей Х-инактивации ( Allen et al., 1992 ).
Одним из самых основных преимуществ этого метода является его высокая эффективность, поскольку гетерогенность данного участка составляет 90% ( Allen et al., 1992 ). Помимо этого, использование количественной ПЦР с флюоресцентными праймерами позволяет избегать проведения экспериментов с радиоактивностью. Среди недостатков следует отметить, как и для предыдущих методик, возможность неполной рестрикции, в связи с чем, соотношение метилированных и неметилированных аллелей не будет соответствовать реальной картине. В работе Kubota (2001) предлагается избегать подобного недостатка с помощью обработки геномной ДНК бисульфитом натрия, в результате чего происходит химическое превращение 5'-метилцитозина в урацил, следовательно, метилированый аллель не амплифицируется. Тем не менее, следует отметить, что данная модификация имеет практически идентичный недостаток, поскольку химическая модификация геномной ДНК бисульфитом натрия также может пройти не полностью. Поэтому было предложено упростить данный метод и проводить рестрикцию лишь сайтов HpaII и учитывать интенсивность аллелей, необработанных ферментом, чтобы избежать дополнительных ошибок, связанных с неполной амплификацией и рестрикцией ( Villard et al., 2000 ; Villard et al., 2001 ; Plenge et al., 2002 ).
Метод исследования особенностей Х-инактивации, основанный на метилчувствительной рестрикции HpaII сайтов в интроне 1 гена андрогенного рецептора (HUMARA) с последующей количественной ПЦР , является наиболее распространенным для анализа особенностей Х-инактивации.
