РНК редактирование мРНК ароВ гена
Хорошо изучен процесс редактирования мРНК аполипопротеина B (APO B) млекопитающих , участвующего в транспорте холестерина и триглицеридов в крови. Эдитинг у млекопитающих был впервые открыт при анализе экспрессии гена аполипопротеина B была показана тканеспецифичность этого процесса [ Сhen ea 1987 ]. Обнаружены две формы APO B, кодируемые одним и тем же геном и образующиеся в результате редактирования APO B-мРНК ( рис. I.11,а ). Уникальный ген АPO B человека содержит 29 экзонов, и его общая длина составляет 43 т.п.о. Длина мРНК этого гена, кодирующей ApoB100 с молекулярной массой 512 кДа, составляет 14 тысяч оснований (т.о.). В середине самого большого экзона 26 имеется глутаминовый кодон СAA, который в результате редактирования мРНК превращается в терминирующий кодон UAA. Некоторые из мРНК, подвергшихся редактированию, расщепляются по криптическому (не функционирующему до расщепления) сайту полиаденилирования, что приводит к образованию более короткой мРНК длиной в семь т.о. В результате трансляции редактированных мРНК образуется укороченный APO B48 (241 кДа), который содержит 2152 N-концевых аминокислотных остатка APOB100. В функциональном отношении этот белок остается полностью активным, однако у него отсутствует С-концевой домен APO B100, который отвечает за связывание с рецептором липопротеинов низкой плотности. Молекулярным механизмом редактирования APO B-мРНК является сайт-специфическое дезаминирование цитозина с помощью цитидиндезаминазы .
В клетках печени синтезируется полноразмерный белок Аро В100 (512 кДа) с нередактированной мРНК-матрицы, тогда как в клетках тонкого кишечника происходит редактирование: замена 6666-го нуклеотида С на U, в результате чего образуется стоп-кодон и синтезируется белок меньшего размера Аро В48 (241 кДа). Два белка, транслирующиеся на ароВ- матрице, выполняют различную роль в метаболизме липидов: АроВ48 задействован в транспорте жиров, поступающих с пищей и всасывающихся в кишечнике, тогда как Аро В100 вовлечен в транспорт эндогенно синтезированных триглицеридов и холестерола . Механизм редактирования аро В мРНК был разработан во многом благодаря созданию in vitro системы эдитинга аро В мРНК [ Driscoll ea 1989 ]. Оказалось, что катализирует превращение цитидина в уридин фермент, названный APOBECI . Клонировали ген, кодирующий этот фермент у человека, и полностью определили его первичную структуру. Показано, что цитидиндезаминаза человека, осуществляющая редактирование APO B- мРНК, представляет собой димер, построенный из двух идентичных субъединиц (АРОВЕС1) с молекулярной массой 28 кДа. Ген фермента, расположенный на хромосоме 12, экспрессируется исключительно в тонком кишечнике.
Данный фермент взаимодействует с 22-членной следовательностью аро В мРНК, 4 нуклеотида второй предшествуют редактируемому цитидину Находящийся ниже Ced AU-богатый участок +5'- +15 нуклеотидов (5'- UGAUCAGUAUA-3') является "критическим" (mooring sequence): большинство изменений в нем нарушают или совсем аннулируют редактирование [ Navaratnam ea 1995 , Chang ea 1998 ]. Участок связывания APOBECI с мРНК от +12 до +17 от Ced (5'-UAUAUU-3') перекрывается с вышеуказанной последовательностью. Поскольку APOBECI является гомодимером, предполагают, что одна из его субъединиц связывается с AU-богатой последовательностью (+5 - +15), тогда как другая оказывается на фиксированном расстоянии до Ced, обеспечивая его редактирование [ Scott ea 1995 , Lau ea 1994 ]. Для осуществления эдитинга кроме р27 необходимы и другие белки, связывающиеся с мРНК. Такие факторы обнаружены как в тканях, экспрессирующих ароВ мРНК, так и, например, в клетках HeLa и печени млекопитающих, в которых ароВ мРНК отсутствует. Следовательно, эти факторы (один из них - белок 60 кДа) либо участвуют в редактировании и других мРНК, что пока не обнаружено, либо неспецифичны и связаны не только с эдитингом, но и с другими клеточными процессами [ Navaratnam ea 1995 ]. APOBECI выявляется также в других тканях ( семенниках , селезенке , яичниках ), в которых не синтезируется Аро В липопротеин. Вполне вероятно, что этот фермент взаимодействует и с другими РНК-субстратами [ Scott ea 1995 ].
Специфичность дезаминирования остатка цитозина определяется двумя факторами: последовательностью нуклеотидов мРНК в окрестностях этого сайта и белковыми кофакторами, взаимодействующими с каталитической субъединицей цитидиндезаминазы. Перенос методами генной инженерии последовательности нуклеотидов, фланкирующей сайт редактирования, в новые мРНК приводил к тому, что новые рекомбинантные РНК также подвергались специфическому редактированию in vivo и in vitro. В экспериментах такого рода, а также путем замен отдельных нуклеотидов методами направленного мутагенеза определили последовательность нуклеотидов мРНК, отвечающую за специфичность редактирования. Оказалось, что для оптимального осуществления этого процесса необходима последовательность длиной в 55 нуклеотидов, однако и 25 нуклеотидов в окрестностях сайта было достаточно, чтобы редактирование осуществлялось in vitro с 25%- ной эффективностью.
