РНК-интерференция: введение
РНК интерференция (RNA interference, RNAi): способ посттранскрипционного подавления экспрессии генов ( сайленсинга, silencing ), при котором двухцепочечная РНК (dsRNA) индуцирует деградацию гомологичной мРНК . Двухцепочечная РНК при этом распадается на короткие двухцепочечные фрагменты (21-25 п.о.), обозначаемые как малые интерферирующие РНК (small interfering RNA, siRNA) . Возможно, частично РНК интерференция может осуществляться и на транскрипционном уровне, по крайней мере, у некоторых организмов. МикроРНК (miRNA) и siRNA образуются с помощью одного и того же фермента DICER - рибонуклеазы III типа . В отличие от miRNA, siRNA продуцируются из длинных двухцепочечных РНК, попадающих в клетку экзогенно или из dsPHK , образующихся в результате транскрипции в противоположных направлениях одного участка генома.
RNAi стала важным лабораторным методом исследования функций генов в культурах клеток и в живых организмах. При этом синтетическая dsPHK, направленная против определенного транскрипта, добавляется к клеткам, чтобы вызвать RNAi
На избирательное подавление синтеза вирусных белков с помощью механизма РНК-интерференции возлагаются серьезные терапевтические надежды, поскольку интерференция - существующий механизм в клетках, который мешает распространению вирусной инфекции. (Белки, участвующие в этом процессе, были названы интерферонами). В ответ на введение в клетки фрагментов нуклеиновой кислоты длиной более тридцати нуклеотидов (вирусы имеют значительно больший размер) в их цитоплазме запускается мощный интерфероновый ответ, блокирующий весь белковый синтез (т.е. происходит неспецифический защитный ответ клетки на вирусную инфекцию). И вот недавно открыт совершенно новый способ регуляции работы генов в клетках - механизм РНК-интерференции. Выяснилось, что в клетке существует специальный механизм, способный деградировать строго определенные РНК (без участия рибозимов) и таким образом полностью инактивировать её. Этот механизм деградации может быть направлен на любую конкретную РНК - клеточную, бактериальную или вирусную.
Суть механизма РНК-интерференции заключается в том, что при введении в клетки короткой двунитевой РНК (днРНК) она способна вызывать специфическое разрушение той мРНК, с которой имеет гомологию. Сначала днРНК разрезается специальным ферментом на короткие фрагменты размером от 19 до 21 пар нуклеотидов. После небольших химических модификаций эти короткие днРНК образуют специфический комплекс с определенными клеточными белками. В этом комплексе днРНК расплетается и становится однонитевой. Затем короткая однонитевая РНК в силу своей комплементарности взаимодействует со строго определенной мРНК (копией гена-мишени), что является сигналом для "разрезания" последней ферментами комплекса. Образующиеся в результате этого короткие фрагменты мРНК уже не способны обеспечивать синтез полноценного белка. Таким образом, конструируя различные днРНК можно подавлять синтез строго определенных белков в клетке, не изменяя при этом структуру кодирующих их генов.
Первые попытки применить РНК-интерференцию в качестве нового подхода к терапии ВИЧ-инфекции появились в 2002 г. Для того, чтобы использовать механизм РНК-интерференции, внутрь клеток нужно ввести готовые двухцепочечные молекулы РНК рис. 33 . Оптимальный размер таких синтетических РНК составляет 21-28 пар нуклеотидов. Если увеличить ее длину - клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка. Но молекулы РНК синтезировать трудно, они не очень стабильны. Поэтому на практике пользуются возможностями, предоставляемыми рекомбинантными ДНК, которые, будучи перенесенными в клетки, обеспечивают синтез таких днРНК.
С целью воздействия на ВИЧ опробовано несколько вариантов РНК- интерференции. Если первоначально для подавления вируса использовали интерферирующие РНК к вирусным мРНК, то в дальнейшем пришли к выводу, что более целесообразным является направлять днРНК на клеточные мРНК, такие как, например, мРНК, кодирующие вирусный рецептор CD4 и/или корецептор CCR5. Дело в том, что вирусные гены быстро видоизменяются, соответственно изменяется нуклеотидная последовательность вирусной РНК. В результате этого конкретная искусственно синтезированная интерферирующая РНК становится мало эффективной к некоторым вариантам вируса. Клеточные же гены, обеспечивающие взаимодействие вируса с клеткой, стабильны (они изменяются чрезвычайно редко). По этой причине подавление их работы с помощью интерферирующих РНК происходит более надежно. Внимание было обращено на клеточные белки-рецепторы или корецепторы для ВИЧ. Если предотвратить синтез хотя бы одного из них, вирус не сможет проникать в клетку. На клетках, которые растут вне организма (in vitro), были использованы обе стратегии, и они дали положительный результат. Так, показано полное подавление инфицирования ВИЧ макрофагов с помощью комбинации коротких интерферирующих днРНК, направленных против клеточных и вирусных генов. Однократное применение днРНК обеспечивало долгосрочную защиту этих неделящихся клеток от вируса. Обнаружена также возможность подавления размножения ВИЧ в уже инфицированных клетках.
Использование интерферирующих РНК имеет ряд преимуществ по сравнению с антисмысловыми РНК (большая эффективность, меньшая токсичность). Однако до практического применения этой новой технологии к человеку пока еще дело не дошло. Трудность заключается в том, что двунитевые РНК очень нестабильны и быстро разрушаются в организме. Кроме того, надо обеспечить присутствие этих РНК в клетках, пораженных вирусом, а не вообще в организме. На сегодняшний день еще нет надежных способов доставки генов и РНК в отдельные клетки, не отработаны до конца приемы, обеспечивающие длительное пребывание РНК в организме.
Явление РНК-интерференции (RNA interference) было открыто в ходе экспериментов по подавлению экспрессии генов при помощи антисмысловой РНК у C. elegans . Предполагалось, что антисмысловая РНК после комплементарного узнавания мРНК препятствует ее трансляции . Однако в некоторых экспериментах было обнаружено, что инъекции контрольной смысловой РНК вызывают такой же эффект подавления экспрессии гена, как и инъекция антисмысловой РНК ( Fire et al., 1998 ). Более тщательный анализ показал, что агентом, нарушающим экспрессию, является не смысловая или антисмысловая РНК, а двухцепочечная РНК , содержащаяся в качестве примеси в обоих препаратах.
Термин "РНК-интерференция" для феномена специфического подавления экспрессии генов при введении двухцепочечной РНК был предложен Andrew Fire ( Fire et al., 1998 ; Timmons and Fire, 1998 ).
К этому времени был уже подробно исследован механизм действия двухцепочечной РНК в клетках млекопитающих ( Clemens, 1997 ), приводящий к прекращению трансляции всех мРНК независимо от последовательности двухцепочечной РНК. В отличие от этого эффекта двухцепочечной РНК, РНК-интерференция предполагает специфическое нарушение экспрессии только тех генов, которые обладают достаточно большой степенью гомологии с введенной двухцепочечной РНК.
В последующие годы эффективность РНК-интерференции была продемонстрирована у самых разнообразных беспозвоночных животных - трипаносомы, гидры, планарии, C. elegans, дрозофилы и некоторых других насекомых ( Kennerdell and Carthew, 1998 ; Lohmann et al., 1999 ; Ngo et al., 1998 ; Sanchez Alvarado and Newmark, 1999 ). Сиквенс-специфическое действие двухцепочечной РНК было также обнаружено и у позвоночных, в том числе на ранних стадиях развития млекопитающих, на которых, по-видимому, еще не действует неспецифическая система активации протеинкиназы PKR ( Wianny and Zernicka-Goetz, 2000 ; Yang et al., 2001 ).
Уже сразу после открытия РНК-интерференция стала использоваться как мощный и удобный способ специфического подавления экспрессии генов, исходя из их нуклеотидной последовательности, в том числе для массового скрининга генов ( Bargmann, 2001 ; Barstead, 2001 ; Maeda et al., 2001 ; Piano et al., 2000 ). Одновременно начались исследования самого механизма РНК-интерференции с использованием как генетического, так и биохимического подходов.
По мере выяснения действия двухцепочечной РНК в клетках беспозвоночных становилось все более ясно, что феномен РНК-интерференции имеет много общего с другим явлением, открытым за несколько лет до этого у растений - косупрессией.
Косупрессия у растений была обнаружена в ходе опытов по введению путем трансгеноза дополнительных копий генов в надежде получить увеличение экспрессии и в результате - необходимый фенотип. В противоположность ожиданиям исследователей, у трансгенных растений часто обнаруживалось не увеличение, а подавление экспрессии генов, при этом в таких случаях оказывались подавленными не только введенные трансгены, но и нормально экспрессирующийся до этого клеточный ген, обладающий гомологией с введенными трансгенами ( van der Krol et al., 1990 ).
Сходное с косупрессией явление было обнаружено также у гриба Neurospora и названо quelling ( Romano and Macino, 1992 ). Сейчас становится ясно, что РНК-интерференция и косупрессия у растений входят в широкий круг явлений, названный зависимым от гомологии подавлением экспрессии генов (HDGS) (homology-dependent gene silencing) ( Birchler et al., 2000 ; Cogoni and Macino, 1999b ; Matzke et al., 2001a ). Сюда относятся все явления, при которых наблюдается подавление экспрессии как на транскрипционном, так и на пост-транскрипционном уровне, требующее наличия высокого уровня гомологии между взаимодействующими генами.
По-видимому, различные явления HDGS могут осуществляться разными механизмами, включающими ДНК-ДНК-, ДНК-РНК- и РНК-РНК-взаимодействия, и необязательно с участием двухцепочечной РНК.
С другой стороны, в последнее время начинает проясняться связь многих, казавшихся ранее различными, феноменов HDGS. Вполне возможно, что дальнейшие исследования приведут к представлению о едином механизме HDGS, проявляющемся на транскрипционном или пост-транскрипционном уровне в различных системах.
