РНК-интерференция: условия функционирования siRNA
Биохимические исследования показали необходимость присутствия 3'-гидроксила для функционирования siRNA . Обработка эмбрионального экстракта дрозофилы микрококковой нуклеазой после процессинга двухцепочечной РНК приводила к нарушению РНК-интерференции ( Hammond et al., 2000 ; Lipardi et al., 2001 ). При этом количество siRNA, в противоположность другим одноцепочечным и двухцепочечным РНК, не уменьшалось, по-видимому благодаря защите от деградации белками комплекса RISC .
Однако частичная деградация микрококковой нуклеазой незащищенных белками концов siRNA должна приводить к превращению 3'-конца, содержащего гидроксил, в 3'-фосфорилированный конец.
Действительно, обработка таких siRNA фосфатазой делает их вновь полностью активными в РНК-интерференции ( Lipardi et al., 2001 ).
Таким образом, 3'-гидроксил, также как и 5'-фосфат в siRNA являются не просто следствием специфичной активности DICER , но они необходимы для последующих стадий РНК-интерференции. При этом 3'-гидроксил может быть необходим для использования siRNA в качестве затравки для синтеза РНК РНК-зависимой РНК-полимеразой ( RdRP ).
В соответствии с этим предположением было показано, что меченные siRNA способны достраиваться до длинных молекул РНК в присутствии гомологичных молекул одноцепоченой или двухцепочечной РНК.
Следовательно, siRNA способны выступать в качестве праймеров для синтеза новых РНК на одноцепочечной или двухцепочечной РНК-матрице РНК-зависимой РНК полимеразой. Такая активность достаточно процессивна - использование в качестве матрицы одноцепочечной РНК размером в 1682 нуклеотида приводило к синтезу полноразмерных продуктов удлинения siRNA.
Искусственно синтезированный единичный siRNA-дуплекс также способен выступать в качестве праймера для синтеза протяженных молекул РНК, при этом использование в качестве матрицы смысловой или антисмысловой одноцепочечной РНК приводит к синтезу РНК различной длины, соответствующей расстоянию от сайта отжига комплементарной цепи siRNA до 5'-конца одноцепочечной РНК.
Существование siRNA-праймированной активности RdRP не противоречит описанным выше экспериментам, показавшим важность правильной структуры именно антисмысловой цепи siRNA для РНК-интерференции. При использовании siRNA в качестве праймеров in vivo они имеют возможность отжигаться лишь на мРНК, что накладывает ограничения на правильную структуру именно антисмысловой цепи в дуплексе siRNA.
