РНК-интерференция: активность RdRP у C. elegans
На активность RdRP (РНК-зависимой РНК-полимеразы) у C. elegans указывают также эксперименты, в которых репрессия герминально- экспрессирующихся генов вызывалась инъекцией одноцепочечных антисмысловых олигонуклеотидов длиной от 22 до 40 нуклеотидов ( Tijsterman et al., 2002 ).
Широкий диапазон размеров олигонуклетидов, который должен препятствовать их непосредственному включению в качестве siRNA в комплекс RISC , а также необходимость для репрессии активности гена dcr-1 (гомолога Dicer ), предполагает, что антисмысловые олигонуклеотиды выступают в качестве праймеров для синтеза антисмысловой РНК на матрице мРНК, что ведет к образованию двухцепочечной РНК и ее дальнейшему процессингу DCR-1 .
Данные, полученные при исследовании РНК-интерференции на C. elegans in vivo, полностью соответствуют результатам, полученным на эмбриональных экстрактах дрозофилы, свидетельствующими об активности РНК-зависимой РНК-полимеразы с использованием siRNA в качестве праймеров для синтеза протяженных двухцепочечных РНК на матрице мРНК.
В то же время, они не исключают того, что RdRP может начать синтез без участия праймера, используя в качестве матрицы "аберрантную" одноцепочечную РНК, образовавшуюся в результате siRNA-индуцированного разрыва в мРНК. В соответствии с этим биохимическими исследованиями было показано, что RdRP растений может производить как праймер-зависимый, так и независимый синтез РНК ( Schiebel et al., 1993b ).
Известно также участие гена ego-1 , кодирующего белок, гомологичный RdRP растений, в РНК-интерференции в герминальных, но не соматических тканях C. elegans ( Smardon et al., 2000 ).
В то же время транзитивная РНК-интерференция может происходить в соматических тканях, и геном C. elegans содержит 3 других гена ( rrf-1 , rrf-2 и rrf-3 ), гомологичных RdRP ( Sijen et al., 2001a ). Мутация в одном из этих генов, rrf-1, приводит к нарушению в транзитивной РНК-интерференции и исчезновению вторичных , но не первичных siRNA в соматических тканях ( Sijen et al., 2001a ). Более того, такая мутация нарушает обычную (нетранзитивную) РНК-интерференцию в соматических тканях, вызванную введением двухцепочечной РНК или искусcтвенных siRNA, при этом деградация мРНК не детектируется даже при увеличении концентрации двухцепочечной РНК в 10 раз.
В то же время РНК-интерференция в герминальных тканях оказывается ненарушенной при мутации в rrf-1.
Факт полной устойчивости к РНК-интерференции в соматических тканях у rrf-1-мутантов довольно неожидан и свидетельствует об абсолютной необходимости продукта этого гена для двухцепочечной РНК-зависимой деградации мРНК у C. elegans. Это может объясняться недостаточным количеством первичных siRNA, образующихся rrf-1-независимым путем при процессинге исходной двухцепочечной РНК. Действительно, эффективность процессинга меченной двухцепочечной РНК, инъецированной в C. elegans, довольно низка - во фракции siRNA оказывается не более 1% метки ( Parrish et al., 2000 ).
Альтернативным объяснением может быть существование у гена rrf-1 других активностей, помимо РНК-полимеразной, которые необходимы для РНК-интерференции.
Исследование мутаций в двух других генах - rrf-2 и rrf-3, показало, что ген rrf-2 не участвует в РНК-интерференции ни в соматических, ни в герминальных тканях, в то время как мутация в rrf-3 приводит к усилению обычной и транзитивной РНК-интерференции в соматических тканях. Таким образом продукт гена rrf-3 выполняет какую-то негативную функцию при РНК-интерференции.
