Множественная лекарственная устойчивость: эпигенетическая природа
Основным критерием эпигенетического характера регуляции биологического фенотипа предполагается относительно быстрое (в пределах одного или немногих клеточных делений) становление данного фенотипа в ответ на воздействие внеклеточных стимулов. Такой тип регуляции предусматривает активацию транскрипции гена (генов), кодирующего соответствующий фенотип, и/или посттранскрипционный контроль (стабилизация иРНК, регуляция синтеза и функционирования белка). Об индукции транскрипции может свидетельствовать активация промотор-репортерных конструкций после трансфекции ими клеток и обработки экзогенным агентом; дополнительный довод в пользу транскрипционной активации - предотвращение индуцированного стрессом увеличения количества геноспецифической иРНК ингибиторами генной транскрипции.
Использование полимеразной цепной реакции ( ПЦР ) и проточной цитофлуориметрии - высокочувствительных методов выявления малых количеств иРНК и белка - позволяет выявить быстрое развитие MDR1 / Pgp -опосредованной множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) линиях опухолевых клеток человека. В линии Т-лимфоцитарного лейкоза Н9, в которой до воздействия экзогенных стимулов ген MDR1 не экспрессирован (первично чувствительные клетки), повышение количества MDR1-специфической иРНК обнаруживается через 3-6 ч после добавления в культуру химиотерапевтического препарата цитозара в концентрациях, сопоставимых с применяемыми в клинике (10-25 мкмолей) ( рис.1 А), а при обработке более высокими дозами препарата - даже ранее. Повышение иРНК MDR1 не происходит, если в среде вместе в цитозаром присутствуют актиномицин D или альфа-аманитин , классические ингибиторы транскрипции ( рис.1 Б) [ Prasanna H.R., 1975 ]. За 24 ч воздействия цитозара в клетках накапливается P-гликопротеин (Pgp) , выявляемый на плазматической мембране с помощью моноклональных антител ( рис.1 В). Важно, что повышение количества иРНК MDR1 и Pgp обнаруживается в клетках, выживших после однократной обработки цитозаром; через 2-3 недели после удаления препарата и инкубации в культуральной среде эти клетки активно пролиферируют. Повышенное количество иРНК MDR1 и Pgp можно обнаружить в таких клетках спустя по крайней мере 3-6 недель после прекращения обработки [ Chaudhary P.M., 1993 , Komarov P., 1996 , Roninson I.B. ].
Повышение уровня иРНК MDR1 и Pgp не связано с селекцией редких MDR1/Pgp-позитивных клеточных вариантов. В пользу этого говорят следующие факты:
- цитозар не является субстратом для Pgp , но индуцирует повышение уровня иРНК MDR1 ;
- эффект возникает после кратковременной (несколько часов) обработки клеток;
- ПЦР и проточная цитофлуориметрия не выявляют экспрессии гена MDR1 и Pgp в необработанных клетках ( рис.1 А и В) [ Chaudhary P.M., 1993 , Komarov P., 1996 , Roninson I.B. ]).
Получены прямые доказательства быстрого накопления иРНК MDR1 в метастазах саркомы в легочную ткань при интраоперационной перфузии легких доксорубицином [ Abolhoda A., 1999 ]. Повышенное количество иРНК MDR1 выявлялось уже через 20-50 мин после начала перфузии. Эти результаты подтверждают возможность эпигенетической активации МЛУ в клинических ситуациях и согласуются с многочисленными данными о повышении иРНК MDR1 и Pgp в опухолях при отсутствии амплификации гена MDR1.
