Ретровирусные векторы в генной терапии
Ретровирусные векторы используются в работах с трансгенными животными . Для генной терапии используют очень похожие векторы. Количество генетической информации, которое может быть перенесено с помощью этих векторов не очень велико - до 9000 пар оснований. Это либо небольшой эукариотический ген, либо кДНК.
Было показано, что в ряде систем, основанных на использовании стволовых клеток, например в клетках костного мозга, фибробластах, гепатоцитах, кератиноцитах и других, ретровирусы позволяют трансгенам экспрессироваться достаточно долго. Некоторые нюансы связанны с проблемами их использования для целей лечения человека.
Хоть человек и животное, но при этом он все таки человек! Понятно, что введение требуемого гена со своими собственными регуляторными элементами осмысленно только, если удается осуществить экспрессию трансгена в нужной ткани. Использование ретровирусных векторов для пополняющей терапии ограничивается болезнями, где поврежденный ген в нормальном организме регулируется не очень сложно.
Существует несколько трудностей и опасностей для пациентов в использовании ретровирусных векторов для целей генной терапии.
Во-первых, количество псевдовирусных частиц, получаемых из пакующей клеточной линии мало, примерно #106 в миллилитре среды, в которой растут клетки. Этого более или менее достаточно для целей ex vivo генной терапии. Но этого очень мало, когда нужно применить стратегию in vivo. Этот недостаток пытаются ликвидировать, но пока еще рано говорить об стабильном успехе в этом направлении.
Во-вторых, проникновение ретровирусной частицы в клетку абсолютно зависит от наличия на поверхности этой клетки специфического для данного ретровируса рецептора. Поэтому не все клетки так просто инфицируются.
Например пакующая линия клеток , которая была получена первой, так называемая пси2 # пакующая линия , содержит интегрированный в геном клетки геном вируса лейкемии мышей Молони ( Moloney murine leukemia virus ). Это был экотропый вирус, т.е. он инфицирует только мышиные клетки. Почему это так?
А потому что его ENV белок узнает только мышиные рецепторы. Поэтому была изобретена пакующая линия клеток (#am , в которой последовательности, кодирующие родной экотропный белок оболочки вируса Молони, были замещены геном оболочки из другого, амфотропного, вируса Молони. Т.е. вируса, который способен поражать более широкий спектр хозяев. В результате получаемые псевдовирусные частицы приобрели способность проникать в человеческие клетки.
В дальнейшем такие амфотропные пакующие линии были усовешенствованы, чтобы увеличить выход вирусных частиц и уменьшить вероятность рекомбинации дефектного ретровируса с клеточными эндогенными ретровирусами.
В-третьих, также как в трансгенных животных, уровень экспрессии интегрированного в геном хозяйской клетки случайным (более точно, квазислучайным) образом ретровирусного трансгена зависит от эффекта положения. В клеточной популяции трансфецированной ретровирусным вектором разные клетки очень сильно отличаются друг от друга по уровню экспрессии трансгена, поскольку он оказывается в них в разных положениях. Было бы хорошо осуществлять таргетинг векторов к определенному положению в геноме. Работа в этом направлении проводится. Хотя, часто экспрессия достигается достаточно продолжительная нередки и случаи, когда после непродолжительного периода, экспрессия резко снижается или даже полностью подавляется. Иногда это связано, например, с метилированием ДНК. В некоторых случаях провирусные последовательности теряются из генома или перегруппировываются. Иммунная система хозяина может начать отлавливать клетки, которые экспрессируют трансген. Ведь мы не провели его через эмбрион, а ввели в соматические клетки, и иммунная система вполне может решить, что эпитопы, выставленные на поверхности клеток, экспрессирующих трансген - чужие. Существует и такая опасность: интеграция ретровируса в некоторые клетки может инактивировать ген-супрессор опухолеобразования . Это, конечно, очень редкое, но вполне возможное событие. Но, возможно, опасность его не нужно переоценивать, учитывая что для возникновения реальной опухолевой клетки требуется нескольеко мутационных событий.
Наконец, может быть главная неприятность заключается в том, что возможна рекомбинация между дефектным ретровирусом, который сам по себе не опасен, и каким либо из эндогенных ретровирусных элементов в паковочной линии клеток. Геном млекопитающих буквально начинен такими остатками былых инфекций наших предков окружающими их ретровирусами. В результате рекомбинации может возникнуть компетентный инфекционный ретровирус. Поэтому стараются получить такие пакующие клеточные линии, продуцирующие ретровирусный вектор, в которых рекомбинации были бы сведены к минимуму.
Хотя опасность всех этих событий низка, исследователи должны с ней считаться, ведь они конструируют эти системы для лечения людей. Заканчивая рассказ о ретровирусных векторах для генной терапии, напомню еще один их недостаток, о котором мы говорили в лекции по трансгенозу. Ретровирусы интегрируют в делящиеся клетки. Это также ограничивает спектр их применения.
