Аденовирусные векторы для генной инженерии
[ Roemer, ea,1992 , Mulligan, ea, 1993 , Crystal, ea, 1995 ].
Аденовирусные векторы эффективно переносят гены как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, не встраиваются в геном, обеспечивают высокие титры рекомбинантного вируса и высокий уровень экспрессии вводимых генов. Однако используемые в настоящее время аденовирусные векторы вызывают неспецифическое воспаление и антивирусную реакцию клеточного иммунитета, что сокращает длительность экспрессии до недель или месяцев.
Недостатки ретровирусных векторов , побуждают искать другие векторные системы. Наибольшие надежды возлагают на аденовирусы и герпесвирусы. Геномы у этих вирусов представлены двухцепочечными ДНК и достаточно велики: 36 кб у адено- и 150 кб у герпесвирусов. Обычно они не интегрируют в геном клетки хозяина (хотя для герпесвирусов и сообщалось об интеграции отдельных частей вирусной ДНК).
Многие обычные серотипы аденовирусов являются патогенами человека, инфицирующими верхние дыхательные пути. Интактные аденовирусы использовались для целей вакцинации и в результате накопилась большая информация касательно безопасности этой системы для человека. Аденовирусы могут получаться с очень высокими титрами, до 1012 инфекционных частиц в миллилитре культуральной среды. Для целей генной терапии на сегодняшний день в качестве векторов использовали два аденовирусных серотипа, 2 и 5. Аденовирусы проникают в клетку, взаимодействуя с двумя рецепторами. Они хорошо приспособлены для целей терапии in vivo, поскольку дают высокие титры вирусных частиц. Аденовирусы способны реплицироваться и в делящихся и в неделящихся клетках. Они не интегрируют в геном клеток-хозяев и остаются эпихромосомными. Это уменьшает опасность инсерционного мутагенеза, о которой мы говорили в случае ретровирусов. Инфекция пермиссивных клеток аденовирусом приводит к их лизису. Схематически аденовирусный геном представлен на Рис. 3 . Аденовирусный геном может быть превращен в дефектный по репликации путем делеции Е1 области . (Здесь следует оговориться, что требование Е1 гена для репликации не является абсолютным. При высокой множественности инфекции некоторая репликация все же наблюдается и у дефектных по Е1 области аденовирусов. Однако эта способность очень сильно подавлена). Вместо Е1 области может быть вставлен трансген примерно того же размера, что и в случае ретровирусных векторов, т.е. до 10 кб. Для того чтобы обеспечить рост таких репликационно дефектных рекомбинантных вирусов, созданы специальные рекомбинантные клетки, содержащие экспрессирующиеся гены Е1. Это очень похоже на ту хитрость, которую использовали в случае ретровирусов. Эти клетки комплементируют дефект аденовирусного вектора и позволяют ему размножаться и образовывать вирусные частицы, которые не могут реплицироваться в некомплементирующих клетках. На рис. 3 показаны места, в которые может быть встроен трансген. Это области Е1а,Е1b, и Е3. Аденовирусные векторы были использованы недавно для эффективной доставки генов в эпителиальные клетки верхних дыхательных путей in vivo. Этот эпителий является природным местом инфекции для большинства аденовирусов, поэтому в данном случае аденовирусы имеют преимущество перед ретровирусами, поскольку последние, хотя и могут реплицироваться в эпителии, не могут быть получены в достаточно высокой концентрации для целей терапии in vivo. Однако, эпихромосомная локализация имеет и недостатки - продолжительность экспрессии трансгена невелика - недели, в лучшем случае месяцы. А хотелось бы побольше, хотелось бы на всю жизнь, ведь мы чаще всего имеем дело с наследственными , т.е. пожизненными болезнями. В результате аденовирусные векторы придется вводить пациентам не один раз и навсегда, а регулярно. Выдержит ли организм такое насилие?
