Болезнь Виллебранда у собак: диагностика
В настоящее время диагностика болезни Виллебранда у собак в основном проводится путем определения уровней vWF , и нужно отметить прогресс в определении генетических нарушений, лежащих в основе заболевания. Сейчас для некоторых пород собак доступен ДНК-анализ. При анализе vWF он берется как процент от контрольного кровяного депо собаки. Кровяное депо принимается за 100% и часто выражается как 100 единиц. Кровь на анализ должна быть антикоагулирована 3,2%-ной солью лимонной кислоты в соотношении 9/1 крови к антикоагулянту или 15%-ной EDTA в соотношении 1/100. Не следует использовать гемолизированные образцы, так как гемолиз вызывает значительное понижение уровня vWF. Кровь мгновенно центрифугируется, а затем перед анализом замораживается для хранения. Образец должен перевозиться в замороженном виде на сухом льду во избежание оттаивания. В процессе оттаивания может произойти протеолиз. Такое разрушение протеинов приведет к искусственному увеличению vWF при использовании антигенного анализа, поскольку распадание больших мультимеров на малые делает уязвимыми более антигенные участки.
Измерение vWF обычно производится либо электроиммуноанализом, либо с помощью ELISA с концентрацией, выраженной в виде vWF:Ag (антиген). Используя твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), сотрудники Сравнительной лаборатории Корнелльского университета установили следующие диапазоны: нормальный диапазон - от 70 до 180% vWF:Ag; пограничный диапазон - от 50 до 69% vWF:Ag; аномальный диапазон - от 0 до 49% vWF:Ag. В данном анализе не определяется биологическая активность или многомерное распределение. При использовании этой системы собаки в нормальном диапазоне считаются свободными от vWD и едва ли могут быть переносчиками данного заболевания. Собаки в аномальном диапазоне диагностируются как носители vWD и могут передавать этот признак потомству. Собаки в пограничном диапазоне не подходят под определенную классификацию. Ежедневные колебания в vWF:Ag концентрации бывают высокими, поэтому могут понадобиться многочисленные измерения, чтобы установить у собаки vWD.
Многомерное распределение может быть установлено с помощью электрофореза, хотя обычно он имеется в наличии лишь для исследований. Данный способ имеет ценность в больших мультимерах, которые считаются гемостатически более активными. Также можно измерять способность некоторых веществ образовывать совокупность тромбоцитов, которые при некоторых обстоятельствах зависят от присутствия vWF. Анализ кофактора ботроцетина (змеиный яд, BCF) оценивает способность vWF вызывать агглютинацию тромбоцитов с большими мультимерами, имеющими более высокую активность. Обычно величина BCF точно соответствует величинам vWF:Ag. Исключение составляет vWD типа II , при котором BCF ниже, чем ожидалось по сравнению с vWF:Ag, возможно, из-за того, что эти собаки испытывают дефицит в более активных мультимерах больших размеров. В продажу поступил комплект агглютинированных тромбоцитов, основанный на BCF, но его клиническое применение ограничено из-за методологических трудностей.
Для определения наличия нарушений в первичном гемостазе можно измерить у пациентов время кровотечения. При vWD как время кровотечения из кутикулы ( СВТ ; продолжительность кровотечения из ногтя пальца на нижней конечности, который подрезается достаточно коротко для того, чтобы началось кровотечение), так и время кровотечения из слизистых оболочек полости рта бывают продолжительными. Предпочтительнее анализ ВМВТ , так как СВТ также более продолжителен при наличии коагулопатий , таких как гемофилия типа A и гемофилия типа B . ВМВТ измеряется определением длительности кровотечения из небольших стандартных надрезов на верхней губе. Врач отгибает верхнюю губу пациента с помощью марли, обвязанной вокруг верхней челюсти. Благодаря этому открывается внутренняя поверхность верхней губы и происходит слабое переполнение сосудов кровью. С помощью устройства, снабженного пружиной, делаются два небольших стандартных разреза в слизистой оболочке. При выборе участка для разреза следует избегать видимых кровеносных сосудов. При появлении крови ее промокают фильтровальной бумагой через каждые 5 секунд ниже мест надрезов, чтобы предотвратить образование сгустка фибрина над раной. Такое впитывание не должно задевать раны, в противном случае будет нарушено образование макромолекулярного комплекса ферментов, образующего поры в клеточных мембранах тромбоцитов . Анализ заканчивается при прекращении кровотечения из надрезов. Берется усредненное значение данных, полученных из двух надрезов. У здоровых собак ВМВТ проходит менее четырех минут. При оценке результатов ВМВТ важно помнить, что ВМВТ является общим анализом первичного гемостаза. Не только vWD, но и тромбоцитопения , нарушения функции тромбоцитов и васкулит приводят к увеличению длительности ВМВТ.
Физиологические факторы, влияющие на vWF:Ag. Известны разнообразные факторы, оказывающие влияние на измерение уровней vWF:Ag. С течением времени они могут значительно меняться у различных особей, и из-за этого становится очень сложным отделить пораженных животных (переносчиков заболевания) от здоровых, основываясь на одном примере. Когда кровь берут из головной вены, уровень vWF:Ag выше, чем когда ее берут из яремной вены. vWF повышается из-за усиленной нагрузки, эпинефрина и беременности . Влияние щитовидной железы вызывает споры, однако есть данные, показывающие отсутствие взаимосвязей между гипотиреозом и приобретенным vWD.
