Цитокины в противоопухолевом иммунитете
Гены цитокинов применяются в экспериментах по вакцинации опухолевых клеток для повышения противоопухолевого иммунитета. В экспериментах с вакциной из опухолевых клеток проводится трансфекция этих клеток in vitro наряду с переносчиком инфекции, выделяющим представляющий интерес цитокиновый ген. Трансфектируемые опухолевые клетки облучались, чтобы предупредить последующее их деление, но опухолевые клетки могут продолжать образовывать цитокины еще в течение нескольких дней, пока не погибнут. Эти трансфектированные облученные опухолевые клетки затем вводили в мышей. Через несколько недель после вакцинации опухоли мышам вводились дикие (не мутантные, нетрансфектированные и необлученные) опухолевые клетки, чтобы можно было оценить образование иммунитета, специфического для данной опухоли. Наиболее впечатляющие результаты были получены с опухолевыми клетками, трансфектируемыми при помощи гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора ( GM-CSF ), IL-2 , IL-4 , IL-6 и IL-12 .
Экспериментальное лечение уже укоренившихся опухолей, обеспечивают более строгую, клинически более важную оценку генной терапии рака, чем эксперименты с применением вакцинации. Мышам вводились "дикие" (не мутантного типа, немодифицированные) опухолевые клетки, которым позволялось расти до тех пор, пока не образовывалась опухоль умеренных размеров (от 7 до 14 дней). После этого мышам вводилась вакцина, содержащая опухолевые клетки, для оценки ее действия на регрессию опухоли. При данных условиях некоторые цитокиновые гены проявляли эффективность против небольших укоренившихся опухолей, в том числе IL-2 , IL-4 , IL-6 , IL-12 и GM-CSF .
Ни один из этих цитокинов не проявил эффективность против большой опухоли, что вызывает некоторые сомнения относительно конечной пользы такого вида генной терапии для лечения рака у человека с большими опухолями. Причиной отсутствия эффективности против больших опухолей, возможно, является недостаточно мощный противоопухолевый иммунитет, неспособность эффекторных клеток продвигаться в незначительно оснащенные сосудами громоздкие опухоли или неспособность большой растущей опухоли преодолеть высокую степень периферической иммунной толерантности. В некоторых случаях отсутствие эффективности может быть связано с кинетикой роста опухоли. Во многих экспериментальных опухолях у мышей быстрый рост опухоли просто опережает развитие иммунной реакции. Поэтому циторедукция громоздких опухолей может оказаться полезной, если ее провести до начала цитокинновой генной терапии.
Производилась оценка экзогенных клеток почек зеленой мартышки ("веро- клеток"), трансфектированных вместе с человеческим IL-2-геном для лечения злокачественной меланомы собак и фибросаркомы кошек. Животных сначала лечили хирургически и лучевой терапии, чтобы уменьшить размеры опухоли до микроскопического заболевания. Затем пациентам наугад делали повторные инъекции веро-клеток, трансфектированных вместе с человеческой ДНК IL-2, или не проводили дальнейшего лечения. Через 16 месяцев после лечения у 69% контрольных кошек возник рецидив фибросаркомы, в отличие от 31% в группе, где вводились веро-клетки. Через 12 месяцев после лечения 6% контрольных собак все еще были живы, по сравнению с 37% из группы с веро-клетками.
При введении экзогенных трансфектированных клеток вместе с человеческим IL-2 в опухоль вызывалась воспалительная реакция против инородных клеток, и местная экспрессия IL-2 усиливала воспалительную реакцию. Результат, очевидно, был следствием активации NK-клеток . В настоящее время в Швеции и во Франции в стадии разработок находится фаза I испытаний на людях для оценки этого метода генной терапии рака.
Гены, кодирующие цитокины, также могут вводиться in vivo непосредственно в опухоль с использованием одной из нескольких систем доставки, включая липосомы , синтетические конъюгаты, аденовирусные векторы и генную пушку . Преимуществом метода является то, что экспрессия представляющего интерес иммуностимулирующего гена производится непосредственно в окружение опухоли, благодаря чему нет необходимости устанавливать опухолевые клеточные линии и производить трансфекцию опухолевых клеток in vitro. Для противоопухолевого эффекта обычно необходимо многократное введение цитокинового гена. Доказано, что осуществленная с помощью генной пушки доставка ДНК IL-2 в укоренившиеся кожные опухоли у мышей вызывала полную регрессию опухолей ( RENCA-карцинома , b5178Y-лимфома ), частичную регрессию опухолей ( MethA-саркома , SA-1-саркома ) или уменьшение роста опухолей ( Р815-мастоцитома , В16-меланома ). Это выдающиеся результаты, поскольку впервые было доказано, что инъекция ДНК вызывает устойчивую регрессию укоренившихся опухолей у мышей. В добавление к регрессии опухолей у принимавших лечение мышей развивался системный противоопухолевый иммунитет , что приводило к отсрочке начала метастаз, и у большинства мышей увеличилась продолжительность жизни.
Есть сообщения о предварительных результатах лечения собак с оральной злокачественной меланомой , которым вводили серии внутриопухолевых инъекций плазмидной ДНК в комплексе с формулой катионных липидов. Злокачественная меланома у собак является крайне активным заболеванием. Хирургическое вмешательство увеличивает продолжительность жизни у собак с небольшими опухолями (диаметром < 2 см), в то время как большинство собак с обширными опухолями во время диагностики становятся жертвами метастаз в лимфатических узлах и метастаз в легкие в течение 6 месяцев лечения. Лучевая терапия бывает паллиативной для собак с запущенной формой опухоли. Химиотерапия не дает значительного успеха в лечении меланомы у собак.
При генетических иммунотерапевтических исследований меланомы , проводимых на собаках, применялись в комбинации два иммуностимулирующих гена: бактериальный суперантигенный ген ( Staphylococcus энтеротоксин В (SEB) ) плюс цитокиновый ген (или ген GM-CSF или ген IL-2 ). SEB является мощным активатором CD4+ Т-лимфоцитов и CD8+ Т-лимфоцитов и способствует выделению лимфоцитов из нескольких цитокинов, включая интерферон-гамма ( IFN-гамма ), TNF-aльфа , IL-2 и IL-12 . SEB-активированные лимфоциты также развивают сильную противоопухолевую цитолитическую активность и могут вызвать регрессию опухоли при переносе на опухоли мышей. В исследованиях на собаках, цитокиновый ген увеличивал противоопухолевое действие, вызванное суперантигенным геном. Лечение животных производилось внутриопухолевыми инъекциями плазмидной ДНК в комплексе с катионными липидами два раза в месяц, всего 12 и более сеансов лечения.
Производилась оценка пациентов на вызванную лечением токсичность, реакцию на опухоль и продолжительность жизни. Бактериальные суперантигены представляют собой чрезвычайно мощные молекулы, и даже очень низкие их концентрации (до 1 мг) способны вызывать токсичный шоковый синдром у людей и у других млекопитающих, включая собак. Однако побочные эффекты наблюдались лишь у 50 собак, которых лечили внутриопухолевыми инъекциями суперантигена плюс ДНК цитокином. Такое отсутствие токсичности, вероятнее всего, объясняется тем, что местная выработка суперантигенов в опухолевых тканях была достаточной для того, чтобы вызвать местные Т-клеточные реакции, но не достаточна для системной токсичности.
Лечение внутриклеточным SEB и цитокинами давало большой процент реакций опухолей у животных, подвергшихся лечению. Степень реакции (полная или частичная ремиссия) составляла 45% у собак с III стадией опухолей (метастазы лимфоузлов) . Биопсия опухолей, производимая после инъекции ДНК и оцениваемая по иммуиогистохимическому анализу, показала значительный инфильтрат CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток и макрофагов . Таким образом, реакция суперантигена и цитокиновых генов была достаточной для притягивания Т-клеток и макрофагов в окружение опухоли и активации их. Предварительные исследования также выявили очевидность Т-клеточной активации в осушении лимфоузлов у принимавших лечение собак.
У пролеченных собак оценивалась системная противоопухолевая реакция. Степень противоопухолевой цитотоксичной Т-клеточной активности в периферической крови у пролеченных животных на стадии III была высокой по сравнению с теми же данными у не подвергавшихся лечению или не восприимчивых к нему животных. Еще более важно, что продолжительность жизни у принимавших лечение собак была значительно выше, чем у контрольных животных. Таким образом, непосредственная внутриопухолевая экспрессия мощных иммуностимулирующих генов позволяла не только обеспечивать местный контроль над опухолью у собак со спонтанной и высокозлокачественной опухолью, но обеспечить и системные противоопухолевые реакции. Можно ожидать, что прогресс в генной инженерии в дальнейшем улучшит реакцию на этот вид генетической иммунотерапии.
