Электронномикроскопические методы диагностики в ветеринарии
Исследования с помощью электронного микроскопа позволяют точно поставить диагноз при наличии специфических субмикроскопических дифференцированных характеристик. Например, ультраструктурные исследования помогают диагностировать злокачественную меланому при малом количестве меланина , вырабатываемого клетками опухоли. Меланоцитическая природа злокачественной меланомы подтверждается в этих случаях путем обнаружения меланосом или премеланосом .
Фиксация пробы является наиболее важной процедурой в процессах, связанных с биологической электронной микроскопией. Имеющийся в продаже формальдегид, применявшийся обычно в гистологических сборах, служит слабым фиксирующим средством для ультраструктуры, поскольку содержащийся в нем метанол действует в качестве коагулятивного фиксирующего раствора и способствует денатурированию протеина. При идеальной фиксации сохраняются все детали клеточной ультраструктуры, какой она была в момент сбора пробы. Фиксация должна производиться быстро и уверенно, оптимальная фиксация происходит в течение нескольких секунд после сбора проб. Ткань аккуратно разрезается на небольшие кубики толщиной не более 1-2 мм, с помощью острой бритвы или лезвия скальпеля, и эти кубики мгновенно помещают в соответствующий фиксирующий раствор. Как правило, используют двухступенчатую фиксацию глютаральдегидным буферным раствором с фосфатом какодилатом, после чего добавляют тетраоксид осмия. При добавлении 2%-ного глютаральдегида (10 частей фиксатора на одну часть ткани) в 0,05-0,01 М-фосфатный буферный раствор с рН 7,2 получается замечательный фиксирующий раствор для ультраструктур, но он медленно проникает в ткань, из-за чего может произойти аутолизис центральной части плотной пробы. Оптимальным средством фиксации является глютаральдегидный фиксирующий раствор, который хранится при 4*С или готовится свежим, с отрегулированным рН, и перед погружением в него ткани этот раствор можно мгновенно разогреть до комнатной температуры. После выдерживания в течение 1-2 часов при комнатной температуре пробу ткани, помещенную в фиксирующий раствор, вновь охлаждают до 4*С, при этом общее время первичной фиксации составляет 1-3 часа с вечера накануне.
Фиксирующий раствор Карновского , представляющий собой сочетание параформальдегида и глютаральдегида, сочетает в себе фиксирующую мощность глютаральдегида и быстроту фиксации формальдегида. Раствор включает 2,5%-ный глютаральдегид и 2%-ный параформальдегид, добавленные в 0,05-0,1 М-фосфатный какодилатный буферный раствор. С пробой поступают гак же, как описано для глютаральдегида, со вторичной фиксацией в тетраоксиде осмия.
Актиновые сети: формирование и
стабилизация: введение
