Маркирование и клонирование взаимодействующих генов
Для изучения регуляторного каскада, сборки какой-либо клеточной структуры, и т.п., прежде всего необходимо выделить гены, связанные с контролем этого процесса. При этом можно получить мутации, затрагивающие какой-либо процесс, и затем исследовать их взаимодействие, или модифицировать проявление какой-либо мутации, т.е. маркировать заведомо взаимодействующие гены .
Примером первого подхода может служить получение коллекции мутантов cdc (нарушения клеточного цикла), мутантов spo (отсутствие сполуляции, диплоидный мейоз), мутантов ste (стерильность ), мутантов rad (радиочувствительность) и т.д. Используют специальные схемы селекции. Например, при получении коллекции ste мутантов мутагенизированную культуру клеток, маркированных рецессивной мутацией устойчивости, смешивали со штаммом противоположного типа спаривания, чувствительным к антибиотику. Смесь высевали на среду с антибиотиком, на которой могли делиться только только непрокопулировавшие клетки, а затем у выросших колоний проверяли способность к копуляции. Таким образом обогащали культуру стерильными мутантами. Маркированные гены можно клонировать по восстановлению дикого фенотипа. Коллекцию можно пополнить генами, эффект которых проявляется при гиперэкспрессии. Так был клонирован ген IME1 , который при амплификации индуцировал споруляцию у штаммов alfa/alfa. Возможно клонировать семейства гомологичных генов, которые, как правило, обладают сходными функциями (например, гены hsp70 ).
Второй подход также используется часто. Отбор реверсий ras2 привел к получению мутаций bcy1 . У ras2 нарушена репрессия A-киназы . Мутация bcy1 в гене, кодирующем регуляторную субъединицу A-киназы, действует в противоположном направлении: вызывает ее дерепрессию. Такие супрессоры легко клонировать, если они обладают самостоятельным проявлением на фоне дикого типа. Можно также отбирать и усилители эффекта мутации, при этом большей частью невозможен прямой отбор.
Возможен отбор супрессоров, проявляющихся при амплификации. Так были выявлены супрессоры темературочувствительности, вызванной мутацией cdc28 : гены CKS1 , CLN1 , CLN2 . Ген IME2 был клонирован по способности супрессировать при гиперэкспрессии эффект амплификации RME1 .
Предложены также схемы отбора мутаций и клонирования генов , продукты которых входят в белковый комплекс. Так например, предложено сконструировать химерный ген, кодирующий ДНК-связывающий домен белка GAL4p и какой-либо белок Х, предположительно, взаимодействующий с другими белками. Штамм, продуцирующий такой белок, трансформировали банком из фрагментов дрожжевого генома, слитых с последовательностью, кодирующей активаторный домен GAL4p. В тех случаях, когда фрагмент содержит информацию о белке, взаимодействующем с Х, активаторный и ДНК- связывающий домены GAL4p объединяются и индуцируют галактозные гены. По способности усваивать галактозу можно идентифицировать такие клоны ( Fields, Song, 1989 ). Этой схемой до сих пор никто не воспользовался, видимо, из-за ее сложности. Другой способ - отбор супрессоров доминантно-негативных мутаций. Такие мутации можно сконструировать in vitro. При их сверхэкспрессии аномальный белок блокирует функцию целого генного комплекса. Супрессорами доминантно-негативных мутаций видимо будут мутации в генах, кодирующих другие белки комплекса ( Herskowitz, 1987 ).
Во многих жизненоважных генах большинство мутаций приводит к летальности, и жизнеспособные мутанты с определенными изменениями фенотипа отобрать трудно. Трудности возникают и при отборе мутантов по генам с вырожденными функциями. Отбор модификаторов - это способ селекции мутаций в таких генах. Для того, чтобы выявить максимум генов, необходимо сочетать оба подхода.
