Инактивация белков иммунности
Влияние инактивации белков иммунности на скорость роста клеток- продуцентов McC .
Как описано выше, утеря гена иммунности mccF кластером mcc не нарушала продукцию антибиотика McC51 , для которой было достаточно лишь генов оперона mccABCDE . Однако мы обнаружили, что внесение стоп-кодона в начало гена mccE в составе оперона mccABCDE на высококопийной плазмиде (производной от плазмиды pUC , имеющей 100-200 копий на клетку) нарушает продукцию McC. В клетках, трансформированных такой мутантной плазмидой не только отсутствовала продукция McC ( Табл. 3 ), но и в стационарной фазе роста переставала поддерживаться сама плазмида, несмотря на присутствие селективного антибиотика ампициллина .
По всей видимости, такой эффект связан с высокой токсичностью мутантной плазмиды. Действительно, в отсутствие трансляции mccE остается лишь один белок иммунности, MccC , экспортная помпа, выводящая синтезированный McC из клетки. McC становится токсичен после процессинга цитоплазматическими олигопептидазами. При трансформации мутантной плазмидой клеток штамма дельтаABN, которые не способны процессировать McC и потому полностью устойчивы к нему [ Kazakov, 2008 ], не наблюдалось потери плазмиды и детектировался синтез McC.
Это наблюдение подтверждает связь потери плазмиды с высокой токсичностью для клеток дикого типа и экспрессии оперона со стоп-кодоном в начале mccE.
Для дальнейшего изучения влияния синтеза антибиотика на клетки-продуценты McC мы провели серию экспериментов по удалению белков устойчивости. Для предотвращения потери плазмид, не содержащих активных белков устойчивости к McC, все дальнейшие эксперименты проводили с использованием плазмиды pp70 , производной от pBR322 и имеющей относительно низкую копийность (10-20 копий на клетку). Кроме того, во всех случаях ампициллин заменяли на его более стабильный и устойчивый к действию бета-лактамаз аналог, карбенициллин .
В разделе " Особенности регуляции экспрессии mccF показано, что ген mccF экспрессируется с самого начала роста культуры клеток. Однако неясно, влияет ли отсутствие экспрессии mccF на скорость роста клеток-продуцентов McC. Здесь и далее для исследования влияния белков иммунности на рост клеток и продукцию McC, использовались точечные мутации, инактивирующие иммунную функцию белков устойчивости. В отличие от генных делеций, точечные мутации позволяют инактивировать белок, не изменяя размер плазмиды (который также влияет на скорость роста клеток) и не затрагивая возможные сайты транскрипционной регуляции экспрессии соответствующих генов.
Белок MccF представляет собой пептидазу, способную расщеплять карбоксамидную связь между пептидной и нуклеотидной частями как процессированного, так и не процесированного McC [ Tikhonov, 2010 ]. Сверхпродукция белка MccF делает клетки устойчивыми к действию McC. Для инактивации карбоксипептидазной активности в ген mccF была внесена мутация, приводящая к замене Ser118 в активном центре белка на аланин. Клетки штамма BL21(DE3), трансформированные плазмидой pET , несущей такой мутантный ген mccF, не обладали устойчивостью к McC ( Табл. 3 ). Чтобы оценить влияние активности белка MccF на скорость роста клеток-продуцентов McC, мы получили плазмиду, содержащую такую инактивирующую мутацию в составе кластера mcc. Нами были получены кривые роста кле-ток дикого типа BW25113, несущих плазмиду с полным кластером генов mcc либо с кластером mcc, содержащим мутацию ( Рис. 22 ,А, кривые красного и синего цвета, соответственно). Так как при добавлении глюкозы cAMP-CAP зависимый промотор Pmcc неактивен, то McC не синтезируется ( Табл. 3 ). Кривые роста обеих культур в среде, содержащей глюкозу, очень похожи ( Рис. 22 ,А, ср. пунктирные кривые красного и синего цвета). Контрольная культура клеток, несущих ту же плазмиду, но без кластера генов mcc, растет быстрее и достигает большей оптической плотности за время эксперимента ( Рис. 22 ,А, кривая зеленого цвета).
В отсутствие глюкозы рост клеточных культур с обоими вариантами кластера mcc замедляется ( Рис. 22 ,А, ср. пунктирные и сплошные кривые), и обе культуры достигают меньших оптических плотностей за время эксперимента, чем с добавлением глюкозы. Наблюдаемое ухудшение роста, вероятно, связано с затратами дополнительных ресурсов на синтез McC, или же с токсичностью самого антибиотика. Клетки, несущие кластер генов mcc без мутаций, растут быстрее, чем клетки, несущие кластер генов mcc с мутацией в mccF. Таким образом, наличие функционального MccF положительно влияет на скорость роста клеток, синтезирующих McC. Этот эффект может быть связан как с инактивацией внутриклеточного (эндогенного) McC за счет действия MccF, так и с повышением устойчивости к McC, попадающему в клетку из культуральной среды (экзогенному McC). Чтобы проверить, какой из факторов играет основную роль в данном случае, мы изучили рост культур клеток, к которым через час после начала роста добавляли McC в концентрациях, достаточных для ингибирования роста контрольной культуры клеток, не содержащих mcc кластера [ Kazakov, 2008 ]. Как видно из Рис. 22 ,Б, добавление McC приводило к прекращению роста контрольной культуры (зеленая кривая), но никак не сказывалось на росте культур клеток, несущих кластер генов mcc. Таким образом, наличия белков иммунности MccC и MccE достаточно для защиты от экзогенного McC. Как ни странно, обе культуры клеток (несущие интактный или мутированный кластеры mcc) при выращивании на среде с добавлением глюкозы, также оказались устойчивы к экзогенному McC ( Рис. 22 Б, красная и синяя пунктирные кривые). Не совсем понятно, каким образом в этом случае обеспечивается устойчивость клеток, ведь промотор Pmcc неактивен. Возможно, mccC и mccE экспрессируются с отдельных дополнительных промоторов, либо же активность Pmcc подавлена не полностью.
Вторым белком, обеспечивающим иммунность клеток к McC, является MccE . За инактивацию McC отвечает С-концевой домен MccE, который, как показал биоинформатический анализ, представляет собой ацетилтрансферазу. Для инактивации ацетилтрансферазной активности в ген mccE в составе плазмиды для сверхпродукции белка pET были внесены мутации, приводящие к замене аминокислотных остатков Ser553 и Glu572 в активном центре белка MccE на аланин [ Novikova, 2010 ]. Клетки штамма BL21(DE3), содержащие такую плазмиду, не были устойчивы к McC, в отличие от клеток, несущих плазмиду с немутированным геном mccE. Также были получены плазмиды с полным кластером mcc, содержащим указанную двойную замену в гене mccE, и клетки BW25113, несущие такую плазмиду, продуцировали McC ( Табл. 3 ).
В следующем эксперименте мы сравнили кривые роста клеток, несущих кластер генов mcc, содержащий точечные мутации одновременно в генах mccE и mccF ( Рис. 23 ,А). Видно, что клетки, несущие плазмиду с двумя мутациями, растут почти нормально при добавлении глюкозы, однако их рост очень сильно замедляется в отсутствие глюкозы ( Рис. 23 ,А, ср. сплошные и пунктирные кривые), т.е. в условиях, когда происходит активация синтеза McC. В присутствии глюкозы добавление McC к растущим культурам, несущим плазмиду с двойной мутацией pp70-E-F, замедляет рост клеток, однако не останавливает его полностью, как в случае клеток с контрольной плазмидой. Такая неполная устойчивость к McC может обеспечиваться единственным оставшимся активным белком иммунности, MccC . Как и в предыдущем случае, поскольку промотор Pmcc подавлен добавлением глюкозы, mccC либо экспрессируется с дополнительного промотора, либо же подавление Pmcc при добавлении глюкозы происходит не полностью.
Как можно видеть из Рис. 23 ,А, одновременноe отсутствие активных MccE и MccF приводило к повышению чувствительности клеток к экзогенному McC. Удаление только MccF, напротив, никак не влияло на чувствительность к экзогенному микроцину, но уменьшало скорость роста продуцентов McC. При экспрессии оперона mcc McC сначала оказывается в цитоплазме, а затем экспортируется из клетки. Мы предположили, что MccF необходим для инактивации такого цитоплазматического, эндогенного McC. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели эксперимент с использованием клеток штамма дельтаyejB, у которых отсутствует один из компонентов McC транспортера YejABEF. Клетки этого штамма полностью устойчивы к экзогенному McC, поскольку не способны транспортировать его внутрь клетки [ Novikova, 2007 ]. Клетки этого штамма трансформировали плазмидами, несущими кластер генов mcc с мутациями одновременно в генах mccE и mccF ( Рис. 23 ,Б). Видно, что в этом случае добавление McC не оказывало никакого влияния на рост культур. Культуры без добавления глюкозы, продуцирующие McC, росли очень медленно, в случае же добавления глюкозы и блокировки синтеза McC рост происходил быстро. Наконец, мы проверили влияние отсутствия только активного MccE в клетках дельтаyejB, синтезирующих McC ( Рис. 23 ,В). В этом случае добавление глюкозы несколько ускоряло рост. В отсутствие глюкозы культуры также росли довольно быстро, в отличие от культур клеток, несущих оперон с мутациями в обоих генах иммунности. Поскольку экзогенный McC никак не влияет на рост культуры клеток штамма дельтаyejB, остается предположить, что именно высокая концентрация эндогенного McC приводила к замедлению роста этой культуры при отсутствии активного белка MccF. Скорость роста клеток с активным MccF и неактивным MccE значительно меньше изменяется при добавлении глюкозы, чем скорость роста клеток, несущих mcc кластер с обеими мутациями, что также подтверждает гипотезу о главенствующей роли MccF в инактивации эндогенного McC. В литературе закрепилось мнение, что белок MccF локализован в периплазме [ Destoumieux-Garzуn, 2002 ]. Наши данные позволяют предположить, что хотя бы часть белка находится в цитоплазме, где он расщепляет зрелый McC.
