Регуляция экспрессии генов у бактерий: краткая информация
Целью настоящего обзора является знакомство читателя с основными известными на сегодняшний день системами регуляции экспрессии генов посредством аттенюации транскрипции .
Бактерии обладают множеством механизмов регуляции процесса экспрессии генов на уровне транскрипции и трансляции, которые позволяют клеткам тонко подстраиваться под изменение условий внешней среды. Под экспрессией гена подразумевают передачу генетической информации, содержащейся в линейной последовательности ДНК гена, в определенное количество генного продукта (РНК или белка), обладающего конкретной функцией. Изменять уровень экспрессии можно, регулируя как активность трансляции уже синтезированного транскрипта (для генов, кодирующих белки), так и количество транскриптов, синтезируемых с определенного гена или группы генов (для генов, кодирующих белки и нетранслируемые РНК). Соответственно, разделяют трансляционный и транскрипционный механизмы контроля экспрессии генов. Почти всегда совместно используются оба механизма, однако транскрипционный контроль, или изменение равновесных концентраций транскриптов, по-видимому, является основным.
Равновесная концентрация транскрипта в клетке определяется скоростями а) синтеза и б) деградации транскрипта. У Escherichia coli транскрипты 80% генов имеют сходные времена полужизни, от трех до восьми минут [ Bernstein, 2002 ]. Несмотря на то, что имеются данные о том, что скорости деградации транскриптов функционально близких генов особенно близки [ Bernstein, 2002 ; Selinger, 2003 ], по-видимому, контроль скорости деградации РНК в целом в меньшей степени участвует в контроле уровня экспрессии генов, чем скорость синтеза РНК.
Процесс транскрипции удобно рассматривать в виде цикла, состоящего из инициации, элонгации и терминации. У бактерий инициация транскрипции начинается со связывания холоферментом РНК-полимеразы (комплекса кор-фермента и сигма-субъединицы ) последовательности расположенного перед геном промотора и формирования закрытого промоторного комплекса. Затем следует переход из закрытого в открытый комплекс, в котором цепи ДНК в положениях от -10 до +2 (где +1 - точка старта транскрипции) расплетаются с формированием транскрипционного пузырька ( Рис. 1 ), и начинается матричный синтез РНК. Сначала происходит несколько циклов абортивной инициации, или абортивной транскрипции, при которой синтезируются короткие молекулы РНК. Такие абортивные продукты отделяются от фермент-промоторного комплекса и выходят из активного центра РНК-полимеразы (далее РНКП) , после чего происходит реинициация синтеза РНК без диссоциации РНКП с промотора. Когда РНКП удается синтезировать достаточно длинный РНК-продукт (от 9 до 16 нуклеотидов в зависимости от промотора), происходит, наконец, "убегание" с промотора (promoter escape). РНКП продвигается дальше по матрице, освобождая промотор и расплетая новые участки ДНК по ходу транскрипции, в то время, как расплавленные пары оснований промотора, "схлопываются" и вновь образуют двуцепочечную ДНК. Сигма-субъединица диссоциирует из транскрипционного комплекса. На этом инициация транскрипции завершается и начинается стадия элонгации. В элонгационном комплексе транскрипционный пузырь имеет размер примерно 14 нт ( Рис. 1 ). 3'-концевая область транскрипта образует РНК/ДНК гибрид с матричной цепью ДНК в транскрипционном пузыре длиной 9 пар нуклеотидов. Ранее синтезированная РНК отделяется от гибрида и выходит наружу через предназначенный для этого канал в РНКП, гибрид образуется уже на следующем участке, наращиваясь 3'-концом новосинтезированной РНК. Элонгационные комплексы характеризуются высокой стабильностью: они не диссоциируют ни при понижении температуры, ни при повышении концентрации соли до 1 М и выше.
Элонгация завершается терминацией транскрипции и отделением РНКП и транскрипта от ДНК-матрицы. Существуют два механизма терминации транскрипции. В случае фактор-независимой терминации триггером терминации служит определенная последовательность РНК. Классический фактор-независимый терминатор представляет собой GC-богатую шпильку, за которой следует участок из нескольких уридиновых остатков. Шпилька начинает формироваться еще в выходном канале РНКП, создавая механическое напряжение, а наличие в транскрипционном пузыре легкоплавкого РНК-ДНК гибрида U-A облегчает "выдергивание" синтезированной РНК из РНКП и завершение транскрипции [ Artsimovitch, 1998 ; Gusarov, 1999 ]. Для фактор-зависимой терминации необходимо наличие специальной последовательности rut (Rho utilization site) на насцентной РНК, с которой связывается стимулирующий терминацию белковый фактор ро [ Santangelo, 2011 ].
Регуляция транскрипции генов возможна на каждой из стадий транскрипционного цикла. Прежде всего, интенсивность транскрипции гена определяется тем, насколько часто холофермент РНКП связывается с промотором и насколько быстро переходит от абортивной инициации к элонгации. Холофермент представляет собой комплекс кор-фермента, осуществляющего матричный синтез РНК, с сигма фактором , узнающим последовательность промотора [ Watson, 2004 ]. Сила промотора определяется его аффинностью к данному холоферменту, то есть близостью к консенсусной последовательности, узнаваемой данным сигма-фактором. У E. сoli, самый распространенный сигма-фактор сигма70 , ответственный за транскрипцию генов домашнего хозяйства, узнает промоторы, образованные двумя шестинуклеотидными последовательностями, районами -10 и -35 (названными так по характерному положению относительно старта транскрипции), разделенными спейсером в 14-17 п.о. Последовательности и расположение районов, узнаваемых альтернативными сигма-факторами, могут значительно отличаться. Инициация транскрипции может дополнительно модулироваться транскрипционными факторами, регуляторными ДНК-связывающими белками, ингибирующими (репрессоры) или стимулирующими (активаторы) связывание холофермента с промотором.
Область перед геном, содержащая сайты связывания транскрипционных факторов, называется оператором . Регуляция может происходить как на уровне отдельных промоторов, так и на уровне целых регулонов - наборов генов, имеющих одинаковые регуляторные области в прилегающих к ним промоторных участках. Примером такой множественной регуляции у E. coli может служить активация генов регулона альтернативного сигма фактора сигма32 при тепловом шоке или регулона CAP (catabolite activator protein, белок-активатор катаболитных оперонов) при голодании по глюкозе, приводящих к сложному физиологическому ответу на стресс , такому как синтез защитных белков- шаперонов [ Yura, 1993 ] в первом случае или использование альтернативных источников углерода [ Zheng, 2004 ] - во втором.
Также известны многочисленные случаи регуляции транскрипции на уровне элонгации . Продвижение РНКП по ДНК матрице происходит не с постоянной скоростью, а зависит от нуклеотидной последовательности и способности синтезируемой РНК к образованию вторичных структур. Определенные структуры и последовательности стимулируют паузирование или остановку (арест) транскрипции [ Artsimovitch, 2000 ; Larson, 2014 ], или же приводят к терминации транскрипции [ Artsimovitch, 1998 ; Santangelo, 2011 ]. В преодолении различных затруднений при элонгации принимают участие также белковые факторы, которые связываются с РНКП и облегчают преодоление транскрипционных пауз ( GreA и GreB , Nus G ), стимулируют терминацию транскрипции и освобождение РНКП ( NusA , NusG , ро ) [ Proshkin, 2011 ].
Предмет настоящего обзора, аттенюация транскрипции , также является механизмом регуляции экспрессии генов на уровне элонгации, многочисленные примеры подобной регуляции будут подробно рассмотрены ниже.
В широком смысле аттенюация транскрипции - это любой механизм, использующий паузирование или терминацию транскрипции для регуляции экспрессии расположенных ниже по ходу транскрипции генов [ Gollnick, 2002 ]. В более узком смысле аттенюация - это преждевременная терминация транскрипции [ Naville, 2009 ]. Под "преждевременной" в данном случае подразумевается терминация транскрипция раньше конца последнего гена в опероне .
В общем случае аттенюатор представляет собой регуляторный элемент РНК , расположенный в 5'-нетранслируемой области гена или оперона, способный формировать две альтернативные структуры: антитерминатор и терминатор транскрипции. Также в состав аттенюатора входит сенсорный элемент, способный связываться с регуляторным фактором. Связывание регуляторного фактора с сенсорным элементом приводит предпочтительному образованию одной из альтернативных структур аттенюатора. Сенсорный элемент может быть расположен отдельно или же входить в состав антитерминатора или терминатора.
В зависимости от набора образующих их компонентов, аттенюаторы можно разделить на несколько групп, основные из которых представлены на Рис. 2 . Классические аттенюаторы функционируют в составе насцентной РНК и кодируют короткий лидерный пептид, при трансляции которого рибосома блокирует формирование одной из структур аттенюатора, но дает образоваться второй ( Рис. 2 , А). Такой механизм, например, запускает экспрессию оперонов биосинтеза многих аминокислот у грамотрицательных бактерий при нехватке соответствующей аминокислоты. Аттенюация может также происходить посредством специализированных РНК-связывающих белков, которые стабилизируют одну из двух структур насцентной РНК, как изображено на Рис. 2 (Б и В). В отдельную группу выделяют аттенюаторы, в которых в роли РНК- связывающих белков выступают рибосомальные белки ( Рис. 2 , В).
В другой группе аттенюаторов одну из альтернативных структур насцентной РНК стабилизирует связывание незаряженной тРНК . Типичным примером являются T-боксы грамположительных бактерий ( Рис. 2 , Г). Наконец, многие гены содержат в регуляторном участке РНКовые сенсоры, или рибопереключатели ( Рис. 2 , Д), которые способны изменять конформацию в ответ на связывание низкомолекулярных метаболитов или при изменении физико-химических ус-ловий (температуры, pH и т.д.).
Целью настоящего обзора является сравнительная характеристика известных на сегодня молекулярных механизмов аттенюации.
