Картирование хромосом: Метод микродиссекции
Другим важным методом клонирования определенных областей генома является метод микродиссекции.
Этот метод был предложен в 1981 г. F. Scalenghe с соавт. [ Scalenghe F. e. a., 1981 ] для картирования специфических последовательностей политенных хромосом Drosofila melanogaster. Суть метода заключается в том, что из метафазных хромосом под микроскопом вырезают интересующий участок, который затем клонируют, получая специфическую для данного района библиотеку.
В 1984 г. D. Rohme с соавт. [ Rohme D. e. a., 1984 ] использовали его для получения проб определенного участка генома млекопитающих (им удалось получить ряд проб t-комплекса мышей), а в 1985 г. E.M.C. Fisher с соавт. использовали его для получения проб из проксимального района Х-хромосомы мышей [ Fisher E.M.C. e. a., 1985 ].
В 1986 г. G.P. Bates с соавт. [ Bates G.P. e. a., 1986 ] смогли применить метод микродиссекции для исследования генома человека. Авторы этой работы таким образом получили библиотеку последовательностей дистальной части короткого плеча хромосомы 2 человека в векторе gt10. 41% из 257 потенциальных рекомбинантов содержали человеческие вставки, из которых высокоповторяющиеся последовательности содержались менее, чем в 10% клонов. Все уникальные последовательности из этой библиотеки были картированы на коротком плече хромосомы 2, подтверждая таким образом специфичность полученной библиотеки. Таким образом, было доказано, что микродиссекция является достаточно быстрым и эффективным методом получения библиотек, специфичных для определенных хромосомных участков.
Примером массированного использования этого подхода может служить работа L.M. Davis с соавт. [ Davis L.M. e. a., 1990 ]. Эта группа сконструировала геномную библиотеку, состоящую из 20 000 клонов, обогащенную последовательностями полосы 11p13. Из этой библиотеки было выделено 1500 клонов, из которых 250 были проанализированы и 58 картированы, используя панель гибридных клеток человек-хомяк. 6 клонов были использованы для завершения физической карты протяженностью 7,5 Мб. 3 клона попали в район опухоли Вилмса ( WT ), 3 - в районе Анридия ( AN2 ), и два между этими локусами. По оценкам авторов библиотека состоит из последовательностей ДНК, происходящих из района протяженностью около 13 Мб со средней плотностью около 1 клона на 37 000 пар оснований.
Применение метода микродиссекции было значительно облегчено использованием PCR-амплификации продуктов. PCR-амплификация позволяет также увеличивать размеры клонов. Например, A. Rosenthal с соавт. [ Rosenthal A. e. a., 1991 ] использовали изобретенный ими метод " PCR-прогулки " для удлинения клонов, полученных при микродиссекции района Xq27.2. Суть метода заключается в следующем: ДНК исследуемого генома расщепляют рестриктазой, к полученным фрагментам подшивают олигонуклеотидные кассеты. Затем проводят линейный PCR с биотинилированного праймера , соответствующего исследуемому клону. С помощью авидина связывают биотинилированные молекулы, то есть те, которые содержат на одном конце биотинилированный специфический праймер. Затем с помощью праймера, соответствующего пришитой кассете и специфического праймера, соответствующего исследуемому локусу, амплифицируют те молекулы, которые связались с авидином. Для повышения специфичности полученных фрагментов проводят второй раунд PCR полученного продукта, используя праймер, соответствующий пришитой кассете и второй специфический праймер, соответствующий исследуемому локусу и расположенный с некоторым сдвигом относительно первого специфического праймера. При этом исходный фрагмент удлиняется за счет ДНК, находящейся между исходным локусом и сайтом расщепления использованной рестриктазы.
Таким образом клон M54 был удлинен примерно на 700 нуклеотидов в обе стороны, прямое секвенирование полученных продуктов позволило установить, что исходный клон происходил из одного из интронов гена CAM-L1 , кодирующего один из белков клеточной адгезии в нейронах . Эти результаты показывают, что возможно удлинение клонов с помощью PCR на тотальной геномной ДНК человека.
Другим важным усовершенствованием метода микродиссекции, которое стало возможно после изобретения PCR, стало использование амплифицированных продуктов микродиссекции в качестве зонда для скрининга геномных библиотек. Впервые этот подход был использован в 1991 г. M. Djabali с соавт. [ Djabali M. e. a., 1991 ]. Они применили амплификацию материала, полученного при помощи микродиссекции района X-хромосомы, вовлеченного в синдром умственной недостаточности , связанного с феноменом "хрупкого" сайта. Амплифицированный материал был использован как для клонирования, так и в качестве зонда для скрининга ранжированной космидной библиотеки геномной ДНК. Результаты картирования 8 клонов на панели гибридных клеток показали, что они происходят из узкого района вокруг "хрупкого" сайта. Один из клонов содержит эволюционно-консервативные последовательности, что служит указанием на возможное присутствие гена в этом районе.
Использование метода микродиссекции позволило получить маркеры, сыгравшие важную роль в исследовании группы наследственных лейкемий [ Cotter F.E. e. a., 1991 ], нейрофиброматоза-2 [ Fiedler W. e. a., 1991 ], синдрома Лангера- Гидеона ( Langer-Giedion syndrome ) [ Ludecke H.J. e. a., 1991 ], района APC ( adenomatous polyposis coli ) [ Hampton G. e. a., 1991 ], синдрома Беквита-Видеманна ( Beckwith-Wiedemann syndrome ) [ Puech A. e. a., 1992 ] и др.
Помимо средства получения маркеров из заданных районов генома, в настоящее время метод микродиссекции довольно широко применяется для " раскрашивания хромосом ". Это позволяет однозначно идентифицировать фрагменты хромосом и мини-хромосомы, которые появляются в гибридных клетках или при некоторых наследственных заболеваниях (см., например, [ Guan X.Y. e. a., 1993 ]).
Интересным развитием метода микродиссекции стал метод " препаративной гибридизации in situ " ( Prep-ISH по терминологии изобретателей этого метода [ Hozier J. e. a., 1994 ]). Этот метод может применяться для решения таких задач, как, например, создание библиотек кДНК, соответствующих мРНК генов, происходящих из определенного района хромосомы, и является комбинацией двух методов - in situ гибридизации молекул ДНК к метафазным хромосомам и микродиссекции хромосом.
К недостаткам метода микродиссекции относятся техническая сложность и то, что после получения библиотеки необходимо проводить картирование полученных клонов.
