P-гликопротеин: общие сведения
Р-гликопротеин ( гликопротеин с молекулярной массой 170кДа , gp170 , Pgp - белок-переносчик с широкой специфичностью. Исследования in vitro показали, что спектр субстратов Рgp включает не только противоопухолевые препараты, но и препараты, используемые для реверсии МЛУ , флуоресцентные красители, стероидные гормоны ( Bradley, Ling, 1994 ).
Pgp - крупный трансмембранный белок - состоит из двух одинаковых частей, каждая из которых включает шесть гидрофобных трансмембранных участков ( рис. 1 ). Это позволяет считать, что молекула Pgp 12 раз пересекает плазматическую мембрану клетки. Молекула имеет два сайта связывания с АТР ( рис. 1 ), что свидетельствует об энергозависимости функционирования белка.
P-гликопротеин кодируется геном ABCB1. Транспортируя лекарственные препараты из клетки, P-гликопротеин обеспечивает активное выведение цитостатиков , в частности антрациклинов , что способствует при его экспрессии возникновению полирезистентности к противоопухолевым средствам . Показано, что процент полирезистентных форм заболевания увеличивается с каждыми десятью прожитыми годами.
Накопление Р-гликопротеина связано с повышенным уровнем иРНК гена MDR1 , кодирующего этот белок в клетках человека. Установлено, что важнейшей причиной множественной лекарственной устойчивости является пониженное накопление цитостатиков в клетке, обусловленное активным выведением веществ в межклеточную среду. Этот транспорт осуществляется Р-гликопротеином, белком плазматической мембраны, за счет энергии гидролиза АТФ. У человека ген MDR1 (от multidrug resistance 1) локализован в VII хромосоме . Ген, предположительно, сформироваван в эволюции как результат внутренней дупликации примордиальной нуклеотидной последовательности.
Полирезистентным опухолевым клеткам свойственно активное выведение цитостатиков из клетки. В роли переносчиков выступают мембранные белки - Р-гликопротеин и белок MRP (белок полирезистентности с молекулярной массой 190кД). Оба белка, относящиеся к семейству АВС-переносчиков, в избытке экспрессируются полирезистентными линиями перевиваемых опухолевых клеток.
Активность Pgp определяет резистентность опухолевых клеток ко многим противоопухолевым лекарствам ( антрациклиновым антибиотикам , алкалоидам растительного происхождения , в частности к винка-алкалоидам , подофиллотоксинам , таксанам и др.), а также ко многим другим веществам - флуоресцентным красителям , бромистому этидию , пуромицину , грамицидину Д и др.
Бытует шутка, что этот белок и белок MRP определяют резистентность клеток к половине веществ из каталога "Sigma".
Накопление любого вещества-субстрата Pgp снижено в клетках с повышенной функцией Pgp. Это вещество быстрее выходит из клеток с Pgp-МЛУ, ингибитор функции Pgp тормозит процесс выброса препарата [ Egudina S.V. et al, 1993 ].
До сих пор не решен фундаментальный вопрос о биохимии Рgp: как один белок обеспечивает резистентность к широкому спектру разнообразных соединений. Возможная локализация сайта, связывающегося с лекарством, выявилась в результате анализа спонтанных мутаций в генах Рgp, которые были выделены из клеток линий китайского хомячка, резистентных к колхицину . Один из этих мутантов содержал валин на месте глицина в положении 185. Трансформанты, экспрессирующие эту мутацию, демонстрировали измененный профиль кросс-резистентности: увеличивалась резистентность к колхицину, адриамицину , снижалась к винбластину , винкристину и актиномицину Д . Из этих данных можно предположить, что Рgp имеет множественные сайты, связывающие лекарства, и это одно из возможных обьяснений тому, как один белок транспортирует различные вещества.
Р-гликопротеин - это очень консервативный белок. Он имеет гомологию с многочисленными бактериальными и эукариотическими транспортными белками . Показано, что семейство генов pgp принадлежит к суперсемейству генов, которые кодируют АТФ- связывающие мембранные транспортные системы в филогенетически далеких видах. Кроме pgp генов к АВС ( ATF-Binding Cassete ) принадлежит еще ряд генов млекопитающих: CFTR , TAP , MRP ( Bradley and Ling, 1994 ).
Р-гликопротеин кодируется небольшим генным семейством. Клетки грызунов имеют 3 Pgp гена (кодирующие I,II и III классы Pgp) ( Borst and Van der Bliek, 1991 ); клетки человека - 2 (кодирующие I и III классы) ( Chin et al., 1989 ; Roninson et al., 1991 ). Pgp гены класса I и II переносят лекарственную резистентность, будучи трансфицированными в чувствительные клетки, тогда как класс III напрямую не связан с лекарственной резистентностью.
Повышенная экспрессия мембранного белка плазмы Р-гликопротеина является наиболее изученной формой клеточной резистентности препаратов. Резистентность к экспрессии Р-гликопротеина является одним из наиболее важных факторов, ведущих к резистентности данного фенотипа ко многим лекарственным препаратам (множественной лекарственной устойчивости, МЛУ, MDR ). Благодаря MDR раковые клетки приобретают устойчивость к различным препаратам, распространенным в медицине и медицинской ветеринарии, таким как доксорубицин , винкристин , актиномицин D и митоксантрон ( табл. 1(vv20) ). Эти препараты обычно получают из природных источников; они являются гидрофобными, но во всем остальном имеют мало сходных черт в механизмах действия и химических структурах. Не только у раковых клеток вырабатывается резистентность к этим химиотерапевтическим препаратам, но и эти же самые препараты вызывают образование MDR-фенотипа. Гены Р- гликопротеина обнаружены в бактериях, вирусах, растениях, у насекомых, нематод и млекопитающих; столь важное эволюционную сохранность показывает значимость этого гена и его белка.
Р-гликопротеин действует как насос для утечки препарата в клеточную мембрану, которая активно выгоняет препараты из раковых клеток, ограничивая тем самым цитотоксичность данного препарата на участках его действия в клетках. Функции Р-гликопротеина выяснены не полностью, но установлена его экспрессия в здоровых почках, печени, толстом кишечнике, головном мозге, легких, периферической крови и клетках костного мозга, а также в многочисленных эмбриональных клеточных линиях. Поэтому была высказана гипотеза, что Р-гликопротеин обычно действует в качестве насоса, способствующего выделению препарата. Кроме того, было обнаружено, что Р-гликопротеин способствует резистентности к цитотоксичности, вызванной комплементом, и электрохимических избыточных выделений, проходящих через клеточную мембрану. Многие опухоли, выделенные из вышеупомянутых анатомических органов, выделяют большое количество Р-гликопротеина, что позволяет объяснить обычно присущую им резистентность к химиотерапевтическим препаратам.
Клиническая важность MDR при лечении людей со злокачественными новообразованиями, доказывается тем, что увеличение уровня экспрессии Р-гликопротеина определенно соответствует отсутствию реакции или ремиссии после соответствующих видов химиотерапии. Многие исследования Р-гликопротеина сосредотачивались на его местонахождении в клеточной мембране; однако в последних работах высказывается мнение, что Р-гликопротеин также действует в раковой клетке в качестве цитоплазмического вакуольного насоса, создавая еще одну возможность уменьшения цитотоксичности химиотерапевтических препаратов внутри клетки.
В ветеринарии возможным объяснением того, почему у собак с лимфомой после химиотерапи, принимающих циклофосфамид , винкристин ( онковин ) и преднизон (СОР), бывает более короткий период ремиссии, чем у тех, которых лечили только доксорубицином , может служить MDR. Известно, что каждый из двух препаратов из числа СОР вызывают свой MDR-фенотип, в то время как доксорубицин вызывает единственный MDR-фенотип. Аналогично применение кортикостероидов до начала химиотерапии при лимфоме у собак является отрицательным фактором прогноза, обусловленным вероятно индукцией экспрессии Р-гликопротеина, вызванной преднизоном .
Два исследования, проведенных в ветеринарной медицине, показали важность Р-гликопротеина у собак с лимфомой. В первом исследовании методами иммуногистохимического анализа было установлено преобладание позитивной окраски Р-гликопротеина у 58 собак с лимфомой. Пробы, взятые у собак, прошли оценку до начала химиотерапии, во время рецидива, во время некропсии, а у некоторых пациентов анализ проб был сделан во всех трех случаях. В соответствии с предшествующими данными по исследованию Р-гликопротеина у онкологически больных людей, степень экспрессии Р-гликопротеина значительно увеличивается при рецидивах и некропсии в сравнении с ее уровнем в начале химиотерапии. Данное исследование также показало, что уровень окрашивания Р-гликопротеина до начала химиотерапии обратно пропорционален ремиссии и продолжительности жизни; в то же время уровень окрашивания Р-гликопротеина при рецидиве обратно пропорционален времени, прошедшему от рецидива до смерти. Таким образом, пациенты, которых предварительно лечили высокими дозами Р-гликопротеина, имели значительно более короткое время ремиссии и продолжительности жизни, а у пациентов с высоким уровнем Р-гликопротеина при рецидивах значительно сокращалось время, проходящее от рецидива до смерти. Дополнительное поразительное наблюдение заключалось в том, что окрашивание Р-гликопротеина в начале химиотерапии являлось наиболее важным фактором прогноза у всех пациентов, прошедших обследование в данном исследовании (включая, в числе других, фазу заболевания, подфазу, наличие гиперкальциемии, возраст, вес и пол).
Во втором исследовании экспрессия Р-гликопротеина проверялась также методами иммуногистохимического анализа. Обнаружено, что предварительное лечение экспрессии Р-гликопротеина является независимым отрицательным прогнозом общей продолжительности жизни. Кроме того, экспрессия Р-гликопротеина после рецидива была сильнее, чем в пробах до лечения.
Таким образом, определение экспрессии Р-гликопротеина у собак с лимфомой хорошо помогает при предварительном лечении и является средством диагностики во время лечения. И лимфома у собак представляет собой прекрасную сравнительную модель для исследования человеческого Р-гликопротеина.
Существующие многочисленные способы изменения множественной лекарственной устойчивости (MDR), вызванной Р-гликопротеином, к сожаления редко приносят значительную клиническую пользу. Ряд препаратов конкурентно связываются с Р-гликопротеином для подавления его действия ( табл. 1(vv20) ). Однако многие из этих препаратов оказывают неожиданно тяжелое токсичное действие на уровни, необходимые для инверсии Р-гликопротеина. Кривые зависимости "доза-эффект" очень крутые; поэтому одним из путей обхода резистентности является использование более высоких доз у пациентов, что обычно и приводит к значительной токсичности. Поскольку для многих химиотерапевтических препаратов миелосупрессия вынуждает ограничить дозу, исследователи взяли тот же самый ген, который вызывает MDR в раковых клетках, и поместили его внутрь клеток костного мозга. Первоначальные результаты исследований, проводимых на людях, показали, что такая процедура значительно увеличивает переносимость пациентом интенсивных доз химиотерапевтических препаратов. Кроме того, такие лекарственные средства, как препараты, инкапсулированные в липосомах, сигнальные трансдукторы и конъюгаты препаратов в настоящее время находятся в процессе исследования присущей им способности блокировать вызванную Р-гликопротеином MDR.
P-гликопротеиг блокируется циклоспорином .
