NADPH (НАДФН)-зависимая оксидаза: активация: цитозольные факторы, ПКС
Компоненты НАДФН (NADPH)-зависимой оксидазы- Флавопротеид и цитохром Ь558 в гранулоцитах образуют в плазматической мембране непрочный комплекс ( рис. 1А ), который солюбилизируется при действии детергентов. Однако после активации ПМЛ этот комплекс значительно более прочен ( рис. 1Б ) [ Дергунов ea 1983 ]. Причиной такой трансформации оксидазы при активации ПМЛ является встраивание в ее состав двух цитозольных факторов , которые после их фосфорилирования диффундируют из цитозоля и адгезируются на плазматической мембране в районе расположения b-субъединицы цитохрома Ь558 ( рис. 1А , стрелки 10, 11). Механизм встраивания цитозольных компонентов в НАДФН-оксидазу в плазматической мембране не известен. Однако можно сказать, что это происходит в процессе активации оксидазы. Встраивание цитозольных белков и активация НАДФН-оксидазы зависели от концентрации стимулятора, времени стимуляции и температуры среды. Наблюдалась хорошая корреляция между уровнем образования АФК в процессе стимуляции ПМЛ и скоростью транслокации цитозольных факторов на плазматическую мембрану гранулоцитов. Так, при стимуляции ФМА оба параметра были большими, чем при стимуляции фагоцитов ФМЛФ.
Методом иммуноблотинга с использованием SDS-электрофореза показано, что в процессе стимуляции нейтрофилов ФМА или ФМЛФ происходит фосфорилирование ряда белков, локализованных как в цитозоле (67-65,55, 48-47, 38-36, 32-30 кДа), так и в плазматической мембране клеток (70, 78, 46, 40 и 34 кДа). Фосфорилирование белков регулировалось протеинкиназой С [ Chi-Kuang ea 1990 , Pontremoli ea 1986 ]. В пользу этого можно привести следующие доказательства:
1. Совпадение кинетики активации гранулоцитов при стимуляции ФМА и ФМЛФ с кинетикой фосфорилирования цитозольных белков.
2. Влияние ФМА как на формирование KB ПМЛ, так и на активацию клеточной ПКС. Наиболее рациональное объяснение этому следующее: ФМА действует на ПКС , как диацилглицерол , связываясь с ферментом с большей аффинностью (KD = 8 мМ), в стехинометрическом соотношении 1:1 [ Morel ea 1991 ].
3. Распределение ПКС в фагоцитах. В исходных фагоцитах ПКС локализован в цитозоле. Однако после стимуляции он определяется и в плазматических мембранах. Эта транслокация фермента происходит в течение секунд и предшествует кислородному взрыву [ Christiansen ea 1988 , Clark ea 1990 , Green ea 1994 , Jeen-Woo ea 1992 , Morel ea 1991 , Pontremoli ea 1986 ].
4. Введение ингибиторов ПКС ( стауроспорин , С-1 и др.) блокировало как фосфорилирование клеточных белков, так и образование АФК при стимуляции ФМА [ Badwey ea 1989 , Vtsumi ea 1992 ].
Дальнейшие опыты показали, что из всего набора фосфорилированных белков в механизме активации НАДФН-оксидазы наибольшее значение имеют белки с молекулярной массой 47 и 67 кДа [ Clark ea 1990 , Green ea 1994 , Heyworth ea 1991 , Jeen-Woo ea 1992 , Morel ea 1991 , Nause ea 1991 , Pontremoli ea 1986 ]. Необходимость р47 и р67 для активации НАДФН-оксидазы была доказана в ряде экспериментов. Удалось реконструировать активированный комплекс оксидазы в бесклеточной среде, содержащей фракцию плазматических мембран ПМЛ и рекомбинантные p47phox и p67phox (получены с использованием системы Baculovirus); стимуляция комплекса диацилглицеролом сопровождалась образованием АФК [ Leto ea 1989 , Lomax ea 1989 , Uhlinger ea 1992 ]. Несколько отмывок суспензии мембран путем центрифугирования не повлияли на активность реконструированной системы, свидетельствуя о том, что диссоциации его не происходит, а образованный комплекс прочен. Установлено [ Lomax ea 1989 ], что в ПМЛ крови больных лимфогранулематозом кроме дефекта в цитохроме bS58 отсутствуют цитозольные факторы р47 и р67 .
Итак, стимуляция ПМЛ, сопровождающаяся активацией мультикомпонентного оксидазного комплекса, лимитируется стадией фосфорилирования ряда клеточных белков, в обеспечении которого принимает участие Са2+- фосфолипидзависимая ПКС [ Bellavite ea 1988 , Clark ea 1990 , Green ea 1994 , Heyworth ea 1991 , Jeen-Woo ea 1992 , Morel ea 1991 , Nause ea 1991 , Pontremoli ea 1986 , Vtsumi ea 1992 ].
p47 , p67 см. НАДФ оксидаза
