Перемещения генных кассет и их экспрессия
Рассмотрим перемещения генных кассет между стационарными хромосомными и мобильными интегронами и их экспрессию. Большинство генных кассет, находящихся в составе интегронов, не имеют собственного промотора, и экспрессия их генов осуществляется с промоторов рс интегронов. Поэтому в интегронах, содержащих несколько или множество генных кассет, экспрессия некоторых генов может быть слабо выраженной. Collis и Hall сконструировали плазмиды, содержащие фрагменты клонированного интегрона 1-го класса , отличающиеся только порядком расположения в них генных кассет, кодирующих антибиотикорезистентность, и доказали экспериментально, что кассеты, близко расположенные к промотору рс, экспрессируются эффективнее, чем дистальные кассеты [ Collis, 1995 ]. В суперинтегронах , содержащих сотни генных кассет, могут находиться молчащие гены именно из-за их отдаленного расположения по отношению к промотору.
Компьютерный анализ нуклеотидной после довательности суперинтегрона V. cholerae N16961 выявил присутствие в нем ORF , гомологичной гену, кодирующему резистентность к хлорамфениколу (ген catB9 ), хотя сам штамм проявлял чувствительность к этому антибиотику. Чтобы определить, действительно ли эта ORF способна определять резистентность, Rowe-Magnus с соавт. осуществили перемещение данной генной кассеты в сайт интеграции интегрона 1-го класса, InЗ [ Rowe-Magnus, 2002 ]. Для этой цели была использована конъюгативная система, состоящая из двух плазмщ ( рис. 2 ). Первая содержала ген intI1 , кодирующий интегразу IntI1 под контролем индуцибельного промотора trc . Вторая, конъюгативная плазмида R388 имела в своем составе интегрон InЗ . Обе плазмиды были введены в штамм холерного вибриона. После индукции экспрессии гена intI1 плазмида R388 была передана в клетки Е. coli, которые высевались на среду с хлорамфениколом. Несколько резистентных к хлорамфениколу трансконъюгантов были использованы в экспериментах с секвенированием их ДНК, в которых были получены доказательства внедрения кассеты суперинтегрона холерного вибриона в интегрон InЗ. Чтобы проверить, что только генная кассета catB9 ответственна за CmR-фенотип, авторы амплифицировали catB9 холерного вибриона и экспрессировали ее в Е. coli под контролем индуцируемого арабинозного промотора. Найденные трансформанты были устойчивыми к хлорамфениколу, и эта устойчивость проявляла зависимость от индуцируемого промотора. Наконец, чтобы выяснить причину "молчания" кассеты catB9 в составе суперинтегрона, авторы проанализировали последовательность суперинтегрона и определили, что данная кассета по отношению к промотору занимает седьмое положение среди кассет. С помощью делеций, удалявших кассеты, находящиеся между кассетой catB9 и промотором, удалось проявить резистентность к хлорамфениколу, кодируемую catB9, у штамма, содержащего суперинтегрон.
В последующих экспериментах этим же авторам удалось показать перемещение нескольких других кассетных генов суперинтегрона холерного вибриона в состав интегрона InЗ [ Rowe-Magnus, 2002 ]. Были определены 14 независимых перемещений разных генных кассет, включая catB9 и три другие кассеты, потенциально кодирующие резистентность к антибиотикам.
Таким образом, были получены прямые доказательства случайного захвата интегронами множественной резистентности, обычно связанными с мобильными генетическими элементами, генных кассет хромосомных суперинтегронов. Кроме того, на примере молчащего в составе суперинтегрона гена, кодирующего резистентность к хлорамфениколу, показано, что некоторые фентипически чувствительные штаммы могут служить источниками генов резистентности, проявляющих свою активность благодаря рекомбинационным событиям, контролируемым интегронами.
Получены прямые доказательства существования обратного процесса - улавливания и экспрессии генных кассет хромосомными суперинтегронами [ Coleman, 2005 ]. Авторами была сконструирована плазмида, содержащая кассетный рекомбинационный сайт attC рядом с генами aadB и gfr , кодирующими резистентность к гентамицину и флюоресценцию соответственно. Такая конструкция была введена в клетки P. stutzeri Q, содержащие хромосомный интегрон, для изучения рекомбинационной и экспрессионной активностей суперинтегрона. Среди отобранных гентамицинрезистентных колоний была выявлена часть, составляющая 8%, у которых было определено сайтспецифическое включение плазмиды в attI-сайт интегрона. Интегрированная плазмида и фланкирующая ДНК интегрона были клонированы и секвенированы. Результаты анализа нуклеотидной последовательности подтвердили интеграцию всей репортерной плазмиды благодаря сайтспецифической рекомбинации attIPst x attC. Эти эксперименты явились первой демонстрацией улавливания генных кассет хромосомным интегроном дикого типа и экспрессии вновь приобретенных плазмидных генов, включенных рядом с промотором хромосомного интегрона.
