Разнообразие генных кассет и интегронов
Широкое использование новых технологий в микробиологических исследованиях привело к пониманию того, что большинство бактерий, существующих в природе, остается неизученным. Анализ образцов, взятых непосредственно из окружающей среды, проведенный с использованием молекулярно-биологических методов или микроскопии, выявил большое несоответствие между относительно небольшим количеством микроорганизмов, которые культивируются в лабораторных условиях, и числом и разнообразием организмов, действительно существующих в окружающей среде. Неизвестными остаются как генетическое разнообразие этого большинства, так и неоткрытые семейства генов, степень и характер вариабельности у известных генов.
Некоторые свойства, присущие системе ингрон - генная кассета , были использованы рядом авторов, попытавшихся восстановить полные нуклеотидные последовательности новых генов, используя ПЦР и ДНК, выделенную непосредственно из образцов среды обитания бактерий [ Vaisvila, 2001 , Nield, 2001 , Stokes, 2001 , Nemergut, 2004 ]. Проведение таких работ не требовало ни выделения и культивирования бактерий, ни предварительного секвенирования нуклеотидных последовательностей. Предлагая использование такого подхода, авторы основывались на ряде характеристик, полученных ранее для интегронов и генных кассет:
- после открытия ряда хромосомных суперинтегронов у представителей нескольких родов бактерий ( Vibrio , Pseudomonas , Shewanella , Geobacter , Treponema , Nitrosomonas ) стало очевидным, что интегроны имеются у многих разнообразных видов бактерий [ Rowe-Magnus, 2003 , Leon, 2003 ];
- открытие суперинтегронов показало, что пул генов, связанных с кассетами, очень большой [ Rowe-Magnus, 2003 , Rowe-Magnus, 2001 ];
- открытые рамки считывания в рядах кассет в интегронах фланкированы консервативными последовательностями рекомбинационных attC-сайтов примерно из 25 пн, образующими инвертированные повторы [ Stokes, 1997 ], которые могут быть использованы для конструирования праймеров для ПЦР;
- все интегроны содержат гены родственных интеграз, относящихся к одному и тому же семейству тирозиновых сайтспецифических рекомбиназ [ Nunes-Duby, 1998 ].
Первые вырожденные праймеры для идентификации в микробных сообществах генов интеграз были сконструированы и описаны в работе Nield и соавт., использование которых позволило классифицировать три новых класса интегронов. Та же группа авторов сконструировала праймеры на основе лево- и правосторонних консервативных последовательностей attC - сайтов генных кассет (HS286 и HS287; рис. 1 ) [ Nield, 2001 , Stokes, 2001 ]. С помощью этих праймеров были амплифицированы многие гены, фланкированные двумя рекомбинационными сайтами в мультикассетном интегроне. Анализ почвенных, водных и осадочных образцов, собранных в Австралии и Антарктике, показал, что множество независимых образцов, взятых из каждого обследуемого участка, содержали ДНК, способную амплифицировать в ПЦР кассетные продукты. Всего было проанализировано 123 кассеты. 107 из них содержали полные ORF , большинство из которых имели сайты связывания с рибосомами. Были идентифицированы новые гены, имеющие явную гомологию с рядом известных генов, таких как гены фосфотрансферазы, ДНК-гликозилазы, метилтрансферазы, тиотрансферазы. Однако для большинства амплифицированных ORF идентифицированные гомологи в базе данных не были найдены. Ни для одной из ORF не было определено промотора. Более того, в 80% случаев не имелось и места для промотора - границы кассет находились менее чем в 40 основаниях от стартовых кодонов в этих ORF. Это вполне согласовалось с ранее описанными данными об организации генных кассет. В изученных случаях транскрипция генных кассет осуществлялась с промотора рс интегрона.
В другой работе подобную молекулярную технологию использовали для выявления разнообразных интегронов и генных кассет в образцах из рудниковых отходов, содержащих тяжелые металлы, которые создавали для бактерий среду с совершенно другим селективным давлением [ Nemergut, 2004 ]. В результате использования вырожденных праймеров для амплификации генов интеграз и известных и сконструированных новых праймеров для кассетных генов авторы идентифицировали в исследованных образцах 14 ранее неописанных интегразных генов и, кроме того, 11 новых генных кассет. Одна из секвенированных генных кассет имела гомологию с геном, кодирующим одну из ступеней в пути превращений нитроароматических соединений, существенных для выживаемости бактерий в данной среде обитания. Среди генных кассет, обнаруженных в исследованных образцах, имелось много повторов, что могло быть обусловлено селекцией нужных генов в данных условиях. Большинство же секвенированных генных кассет проявляли родство с генами, функции которых до сих пор остаются неизвестными.
В результате упомянутых и ряда других подобных работ четко установлено, что присутствие интегронов характерно для бактериальных геномов, и число классов интегронов, восстановленных из природных источников, сейчас уже превышает число ранее описанных интегронов, обнаруженных в клинических штаммах бактерий [ Nemergut, 2004 , Ochman, 2000 ].
