ЛФХ: регуляция трансмембранного сигнала ПКС
Гидролиз других фосфолипидов, (кроме ДАГ ) в частности фосфатидилхолина , влияет на активность ПКС [ Exton, ea 1990 ]. Влияние ЛФХ на активацию ПКС и механизм этого процесса были изучены на выделенном из мозга крыс ферменте, активность которого наблюдали по степени фосфорилирования гистона HI - основного белка миелина - и двух других миелиновых белков с молекулярной массой 35 и 47 кДа из мозга крысы [ Oishi, ea 1988 ] ( рис. 3 ). В этих экспериментах ЛФХ стимулировал активность ПКС при концентрации менее 20 мкМ и, наоборот, подавлял ее при концентрации более 30 мкМ.
Такое двухфазное регулирование ПКС отличало ЛФХ от "классических" вторичных посредников - ДАГ и НЖК , которые стимулировали активность фермента в широком интервале концентраций и даже при очень высокой концентрации не вызывали его ингибирования.
Необходимо отметить и другие особенности влияния ЛФХ на активность ПКС. Во-первых, стимуляция ЛФХ требовала присутствия фосфатидилсерина и была связана с повышением аффинности фермента к этому фосфолипиду. Во-вторых, так же, как и в случае активации фермента ДАГ или форбол-миристат-ацетатом, для проявления эффекта ЛФХ требовалось присутствие ионов кальция , но в отличие от действия ДАГ и форболовых эфиров ЛФХ снижал аффинность Са#2+ к ферменту. Очевидно, что механизм действия перечисленных трех классов липидных вторичных мессенджеров - ДАГ, НЖК и ЛФХ - был разным. Это подтверждается тем фактом, что в условиях эксперимента in vitro можно было наблюдать синергизм эффектов ЛФХ и ДАГ и аддитивность ЛФХ и НЖК на активацию ПКС [ Oishi, ea 1988 ].
Механизм активации ПКС под действием ЛФХ окончательно не выяснен. Однако Оиши и соавт. [ Oishi, ea 1988 ] отмечают высокую специфичность ЛФХ в отношении активации ПКС, так как они не наблюдали никакой активации других киназ (киназы легких цепей миозина или сАМР-зависимой протеинкиназы). Кроме того, ЛФХ проявлял способность стимулировать ПКС мозга крысы при фосфорилировании только упомянутых выше белков миелина , но не других белков. Эта селективность, возможно, связана с уникальным характером связывания ЛФХ с H1 и 35 кДа- и 47 кДа-белками, что повышает сродство ЛФХ-белкового комплекса к ферменту.
Авторы работы [ Oishi, ea 1988 ] отводят значительное место активации ПКС под влиянием ЛФХ именно в силу особенностей его эффектов, отличных от таковых ДАГ и НЖК. Они отмечают следующий важный факт: максимальная активация ПКС осуществлялась ДАГ при концентрации 5 мкМ, НЖК - 50 мкМ, а ЛФХ - 20 мкМ. Если исходить из допущения, что активация клеточной ПКС будет обусловлена только активацией цитозольной фосфолипазы А2, то ЛФХ оказывается более активным эффектором, чем НЖК. При незначительном уровне стимуляции клеток по этому механизму ЛФХ вообще был бы практически единственным активатором, в то время как при высоком уровне стимуляции клеточной фосфолипазы А2 активирующий эффект НЖК суммировался бы с ингибирующим эффектом ЛФХ, который в такой высокой концентрации играл бы роль негативного эффектора в регуляции ПКС.
Нищизука и соавт. [ Asaoka, ea 1993 , Asaoka, ea 1992 ] получили отличающиеся от предыдущих данные. Обязательная предактивация ДАГ для выявления эффекта ЛФХ на активность ПКС была установлена этими исследователями в экспериментах по ПКС-зависимой экспрессии рецептора интерлейкина-2 и накоплении тимидина в Т-лимфоцитах. Аналогичный результат можно было наблюдать, когда ДАГ заменяли форболовым эфиром [ Asaoka, ea 1992 ]. ЛФХ стимулировал ПКС-зависимую дифференцировку HL-60-клеток в макрофаги, которую оценивали по экспрессии специфического клеточного маркера - CD11b. В любом случае ЛФХ оказывал эффект только в присутствии ДАГ, что является указанием на его участие в передаче трансмембранного сигнала по ПКС-зависимому механизму. Полученные результаты не могли быть вполне объяснены концепцией Оиши и сотр. [ Oishi, ea 1988 ]. Поэтому авторы предприняли собственное изучение in vitro влияния ЛФХ на активность ПКС из мозга крыс [ Sasaki, ea 1993 ]. В отличие от Оиши и сотр. [ Oishi, ea 1988 ] они изучали регуляцию субклассов ПКС. Результаты исследования показали, что ЛФХ в концентрации 10 мкМ был способен заметно усиливать активацию, индуцированную ДАГ, #альфа- , #бета- , #гамма-изоформ ПКС мозга крысы.
В отсутствие ДАГ никакого эффекта ЛФХ на активность ПКС не было отмечено. На другие изоформы он либо не оказывал влияния, либо подавлял их активность. Как и в работе Оиши и сотр, точный механизм активации не был установлен.
Экспериментальные данные позволили авторам предположить, что ЛФХ может индуцировать транслокацию регуляторной части молекулы ПКС из цитозоля в мембрану, т.е. осуществлять первую необходимую ступень сигнальной передачи. Нишизука подчеркивает вспомогательную роль ЛФХ и НЖК при активации клеточной ПКС, которая, по его мнению, заключается в пролонгировании эффектов прямых активаторов - ДАГ или форболовых эфиров [ Nishizuka, ea 1992 ].
Были получены также данные по активации ПКС в ткани аорты кролика под воздействием ЛФХ [ Ohara, 1994 ]. Эффект ЛФХ измеряли по повышению содержания фосфорилированных эндогенных белков в участке аорты и усилению образования супероксид-аниона - O#2- , что является характерным следствием активации ПКС в гладкомышечной ткани артерий . Специфический этих клеток. Кроме того, механизм эффекта ЛФХ, по всей видимости, зависит от гормона или агониста, на систему проведения сигнала от которого влияет ЛФХ. И, наконец, нельзя упускать из виду тот факт, что активация ПКС подавляет путь проведения сигнала через G-белки [ Авдонин ea 1994 ].
Так как следствием активации G-белков является следующее за этим повышение уровня Са#2+, то неизбежно последуют активация цитозольной фосфолипазы А2 и образование дополнительных количеств ЛФХ ( рис. 1 ). Поэтому не исключено, что ЛФХ, образуясь в мембране, действует как метаболит, необходимый для включения обратной связи в гормональном ответе клеток [ Nishizuka, ea 1992 ].
Подтверждением резонности приведенного рассуждения являются данные авторов, которые установили ингибирующий эффект ЛФХ на синтез и выделение NO (эндотелийзависимого расслабляющего фактора) стимулированными брадикинином эндотелиальными клетками аорты быка [ Inoue, N., ea, 1992 ]
Было показано,что ЛФХ подавляет выделение трифосфоинозита и повышение уровня внутриклеточного Са#2+, вызываемые брадикинином в эндотелиальных клетках. Авторы подчеркивают, что механизм отрицательной обратной связи, которая блокирует зависимую от Са#2+ передачу сигнала, обусловленную агонистом, включается через активацию ПКС, т. е. любая возможная активация ПКС в эндотелиальных клетках подавляла бы обусловленные рецепторами процессы, связанные с синтезом расслабляющего фактора. Так как ЛФХ подавляет как промежуточные, так и конечный эффекты брадикинина, он скорее всего, по мнению авторов, запускает механизм отрицательной обратной связи, будучи известным активатором ПКС.
Кугияма и сотр. [ Kugiyama, ea 1992 ] в своей работе на культуре эндотелиальных клеток человека прямо показали, что ЛФХ (1 мкМ) дозозависимым образом ингибирует брадикинин -, тромбин - и гистамин -стимулированное повышение концентрации инозит-1,4,5-трифосфата и Са#2+ в этих клетках, а также слегка активирует ПКС. Авторы предполагают, что именно активация ПКС может быть частично вовлечена (по принципу отрицательной обратной связи) в ингибирование ранней стадии проведения трансмембранного сигнала, наблюдаемое при действии ЛФХ на эндотелиальные клетки [ Kugiyama, ea 1992 ].
