ГМФ (GMP)-синтетаза (GMPS, ГМФС, EC 6.3.5.2) (гидpолизующая глутамин)
EC 6.3.5.2 . ( GMPS , ГМФС ). Тpивиальное название фермента: гуанилатсинтетаза (гидролизирующая глутамин); систематическое название: ксантозин- 5'-фосфат:L-глутамин-амидолигаза (образующая АМР); другие названия: гуанозин-5'-монофосфатсинтетаза или гуанозин- монофосфатсинтетаза (гидролизующая глутамин); GMP-синтаза (гидролизующая глутамин); ксантозин-5'-фосфатамидотрансфераза [ А.Е.Браунштейн,1979 ; D.Schomburg,1990 ].
Описана очистка фермента из фибробластов и эритроцитов человека в 47 раз [ T.Page,1984 ], органов млекопитающих - в 80-100 раз из тимуса теленка [ R.Abrams,1959 ], в 20 раз из печени крысы [ T.J.Boritski,1981 ], асцитных клеток саркомы Иошида крыс в 1400 раз до гомогенного состояния при электрофорезе, изоэлектрическом фокусировании и гель-фильтрации [ K.Hirai et al.,1987 ] и карциномы Эрлиха мышей в 57 раз [ T.Spector,1975 ; T.Spector,1978 ]; печени голубя в 90 раз [ U.Lagerkvist,1958 ] и E.coli В-96 в 180 раз [ B.Y.Lee,1974 ].
Молекулярная масса ГМФС исследована у млекопитающих, птиц и бактерий. Показано, что фермент из печени крысы [ T.J.Boritski,1981 ] имеет молекулярную массу 83000 плюс-минус 6000Д определенную методом гель-фильтрации через колонку с сефакрилом S-200. ГМФС из асцитных клеток саркомы Иошида крысы [ K.Hirai,1987 ] представляет собой мономер с молекулярной массой 78000Д при определении методами гель-фильтрации через колонку с сефадексом G-150 и электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Методом изоэлектрического фокусирования определено, что изоэлектрическая точка (pI) ГМФС равна 5,6 [ K.Hirai,1987 ]. Близкие результаты получены для ГМФС из асцитных клеток карциномы Эрлиха белых мышей , где фермент имел молекулярную массу 85000 Д, определенную методом гель-фильтрации через колонку с сефадексом G-100 [ T.Spector,1975 ].
Дитиотреитол (DTT) активировал ГМФС из фибробластов человека (Ч) и асцитных клеток Эрлиха белых мышей (М) [ T.Spector,1975 ], 2-меркаптоэтанол ингибировал ГМФС из этих источников. GMPS из печени голубя [ U.Lagerkvist,1958 ] незначительно активировалась G-SH.
Для проявления максимальной активности ГМФС требовала присутствия Mg2+ [ K.Hirai,1987 ; N.Patel,1977a ; H.Zalkin,1977 , N.Patel,1975 , B.H.Lee,1974 ; J.M.Buchanan,1973 ] и проявляла лишь 50% активности от максимальной с ионами Mn2+ для ГМФС из тимуса теленка [ R.Abrams,1959 ] и имела очень низкую активность или была не активна с другими двухвалентными катионами металлов: Ca2+, Zn2+, Cu2+, Ba2+, Co2+, Mn2+ [ K.Hirai,1987 ]. ГМФС не требовала ионов К+ для активности [ A.Meister,1973 ].
Максимальная скорость реакции, катализируемой ГМФС, проявлялась при pН ( оптимумы pН ) 6,9 - 7,9 для фермента из тимуса теленка [ R.Abrams,1959 ], 7,8 - 8,0 для фермента из асцитных клеток саркомы Иошида [ K.Hirai,1987 ], около 7 из печени голубя [ U.Lagerkvist,1958 ], 8,3 для фермента из E.coli B-96 [ N.Patel,1977a ].
При исследовании субстратной специфичности было обнаружено, что при замене ATP на UTP, CTP или XTP фермент из тимуса теленка был не активен [ R.Abrams,1959 ]. Для ГМФС из печени голубя [ U.Lagenkvist,1958 ] также было показано, что фермент проявлял специфичность к АТР и инактивировался с CTP, ITP, UTP или АДР 2,5мМ; фермент был не активен с L-глутаматом (L-Glu) и L- аспарагином (L-Asp) до концентрации 0,01 М и не аминировал смешанные изомеры (2' и 3') ХМР, ксантозин, инозин, ксантин, гипоксантин. Для ГМФС из асцитных клеток Эрлиха [ T.Spector,1975 ] показано, что ни один из 10 пуриновых и пиримидиновых трифосфатных нуклеотида не способен был замещать АТР в качестве энергетического донора, но они способны были связываться на центре АТР (Кm для АТР=0,28 мМ), активность с 2'-dATP, Ara ATP, 1,N6-этено-АТР, АМР-Р(NH)P, ХТР, GTP, ITP, CТP, AraСТР, UTP и 2'-dTTP была менее 0,002н моль/мин/ед. Субстратная специфичность ГМФС из асцитных клеток Эрлиха убывала в ряду субстратов: ХМР ; 2'-dXMP ; 8-аза ХМР ; 6-тио ХМР , бета-D-арабинофуранозил-ХМР и 1-рибозилоксипуринол-5-фосфат . Значение константы ингибирования (Кi) было более низким для Ara ATP, чем для CTP и 1,N6-этено АТР.
Наиболее сильные ингибиторные свойства проявлял 8-аза ХМР и наиболее слабые сХМР. При высоких концентрациях АТР (более 5мМ) ингибировал фермент из печени голубя [ U.Lagerkvist,1958 ]. Сильным ингибитором активности ГМФС по отношению к ХМР был 6-тио-ХМР [ T.Spector,1975 ]. Активность ГМФС из асцитных клеток саркомы Иошида [ K.Hirai et al,1987 ] ингибировали гуанин, аденин, циклические нуклеотиды, а также GMP, AMP и CMP.
Антиметаболиты, проявляющие антимикробную и противоопухолевую активности, которые являются ингибиторами биосинтеза нуклеотидов, ингибируют активность ГМФС. К ним относятся: азасерин [ R.Abrams,1959 ; A.Meister,1973 ; E.R.Kaufman,1985 ], 6-диазо-5-оксо- L-норлейцин ( DON ) [ N.Patel,1977a ; A.Meister,1973 ], псикофуранин и декоин [ J.Roberts,1972 ; H.Matsui,1979 б ], микофеноловая кислота [ Т.Франклин 1984 ; J.F.Henderson,1973 ; Sweeney M.J.,1977 ].
Конкурентными ингибиторами активности ГМФС были: азасерин , DON , альфа-фталоилглутамин и изоглутамин , неконкурентными - S-метилкарбамоилцистеин и S-карбамоилцистеин [ A.Meister,1973 ; J.M.Buchanan,1973 ]. Кроме того, активность ГМФС ингибируют ацивицин [ N.Prajda,1973 ; H.N.Jayaramet 1985 ; E.Achleitner,1985 ; Y.Natsumeda,1985 ; G.Weber,1982 ; G.Weber,1985 ; M.S.Lui,1982 ], который является сильным конкурентным ингибитором, прочно связывающимся с ферментом, более слабым ингибитором является тиазофурин [ N.Prajda,1988 ]. Новый нуклеотид с бактериостатической активностью оксанозин является конкурентным ингибитором ГМФС [ N.Yagisawa,1982 ]. Рибавирин более слабый ингибитор активности ГМФС, чем IMP-дегидрогеназы [ D.G.Streeter,1976 ].
Уменьшение активности ГМФС наблюдали также в присутствии дитиобиснитробензойной кислоты (DTNB), бромпирувата , трис-буфера [ N.Patel,1977a ], иодацетамида и L-2-амино-4-оксо-5-хлор-пентановой кислоты [ H.Zalkin,1977 ], гидроксиламина [ R.Abrams,1959 ], фторида , фосфата и PPi [ R.Abrams,1959 ], 3-деазагуаниловой кислоты [ D.G.Streeter,1976 ].
В условиях быстрой пролиферации клеток, как и при эмбриональном развитии или после частичной гепатэктомии и неопластической трансформации активность ГМФС быстро возрастает [ R.C.Jackson,1981 ]; предполагается, что активность ГМФС находится в корреляции со скоростью клеток [ G.Weber,1983 ; K.Hirai et al.,1987 ].
После регенерации клеток печени крысы, происходящей при частичной гепатэктомии, активность ГМФС повышалась, достигая максимума после операции через 24-36ч и составляла от нормы 180% [ K.Hirai,1987 ]. Пуриновые основания и нуклеозиды не оказывали значительного влияния на фермент. Увеличение активности ГМФС, связанное с пролиферацией клеток, изучено на ферменте из цитозольной фракции тканей крыс [ T.J.Boritzki,1981 ]. Активность ГМФС увеличивалась в гепатомах и опухолях почек по сравнению с контрольными тканями. С ростом опухоли активность возрвстала. Активность ГМФС в печени новорожденных крыс была в 2,5 раза выше, чем у взрослых. После частичной гепатэктомии активность возрастала. Активность ГМФС была в 60 раз ниже, чем активность ГМФ-киназы в печени новорожденных, регенеративной печени, трасплантируемых опухолях почки и 11 гепатомах с различной скоростью роста. Изучение изменения активности ГМФС в толстой кишке [ Y.Natsumeda,1985 ] показало, что в карциноме крысы по сравнению с нормой активность возрастает до 280%. В саркоме крысы активность ГМФС по сравнению с нормой увеличивалась в 2 раза [ G.Weber,1983 ], пул GMP возрастал приблизительно в 10 раз. XMP+ATP+Gln=GMP+AMP+Glu+PPi
