Асимметричная супрессия опухолей: общие сведения
Для проведения эксперимента с гибридными клетками необходимо выбрать постоянно растущие линии гибридных клеток. Таким образом, автоматически исключается присутствие в таких клетках генов-супрессоров опухоли, действующих путем индукции остановки роста или апоптоза.
Какие гены могли быть ответственны за подавление развития опухоли in vivo и не оказывать при этом никакого ингибирующего действия на рост клеток in vitro, т.е. для асимметричной супрессии in vivo, но не in vitro?
Такими свойствами обладают по крайней мере три категории генов: гены, продукты которых необходимы для ответа на сигналы дифференцировки in vivo; гены, продукты которых нужны для нормального клеточного ответа на контролирующие факторы со стороны микроокружения; гены, продукты которых ингибируют ангиогенез.
В работе по изучению супрессоров опухолей было сконцентрировано внимание на изучении короткого плеча человеческой хромосомы 3p [ Imreh, 2003 ]. Такой выбор объясняется тем, что при различных видах рака у человека довольно часто возникают делеции некоторых участков этого плеча хромосомы 3, причем чаще всего затрагивается локус Зр21.3 . Было использовано два различных подхода.
"Элиминационный тест" был основан на результатах предыдущих работ по получению гибридов [ Imreh, 1994 ]. Вместо того чтобы получать гибриды нормальных и опухолевых клеток, в опухолевые клетки мыши или человека вносили только нормальную человеческую хромосому 3. Образующиеся "однохромосомные гибриды" несколько раз прививали мышам SCID. Развивающиеся опухоли эксплантировали, а сохранение/удаление последовательностей хромосомы 3 детектировали методами FISH и ПЦР . Были обнаружены две постоянно теряющиеся области (названные CER1 и CER2) и одна часто теряющаяся область (названная FER), состав генов которых был определен в работе [ Imreh, 2003 ] ( рис. 1 ).
Одним из обнаруженных генов был ген лактоферрина (LF) , иногда называемого лактотрансферрином (LTF), который располагался вблизи границы центромерного участка в области CER1. Чтобы проверить, влияют ли присутствие и экспрессия гена LF на элиминацию CER1, была осуществлена и трансфекция клеток фибросаркомы мыши хромосомой PAC, содержащей полный ген под собственным промотором, и кДНК лактоферрина. 14 опухолей из двух независимых особей, полученных путем трансфекции PAC, и из двух независимых особей, полученных путем трансфекции кДНК, анализировали с помощью ПЦР в реальном времени на уровне ДНК и РНК. После пассажа в мышах SCID экспрессия лактоферрина снижалась или исчезала во всех опухолях [ Yang, 2003 ]. В двух опухолях, выбранных для анализа метилирования под действием бисульфита и для секвенирования, шесть сайтов CpG из 14 в промоторе LTF оказывались метилированными в отличие от исходных поддерживаемых in vitro линий, в которых все сайты CpG оставались неметилированными ( рис. 2 ). Кроме того, сообщалось о частой эпигенетической репрессии гена LF в человеческих опухолевых клетках [ Iijima, 2006 ]. Также было показано, что LF действует антиангиогенно [ Norrby, 2001 , Shimamura, 2004 ]. В процессе картирования и секвенирования CER1 был обнаружен и клонирован ген L1MD1 (L1M domain containing gene 1) , также являющийся кандидатом на роль супрессора опухоли in vivo, но не in vitro [ Kiss, 1999 ]. Продукт этого гена принадлежит к семейству зиксинов , про которые известно, что они играют роль в клеточной адгезии [ Grunewald, 2006 ].
Клетки мышиной фибросаркомы, трансфицированные LIMD1-PAC, также хорошо росли in vitro, как и нетрансфицированный контроль, однако их рост в мышах SCID был ингибирован, а их способность расти в метастатических узлах в легких после внутривенного введения была ослаблена [ Sharp, 2004 ].
Е. Забаровский с соавторами сосредоточили свое внимание на изучении двух участков на плече Зр (LUCA и АР20), которые часто подвергаются гомозиготным делениям в некоторых видах опухолей человека. Был выбран определенный набор генов, которые вводили в человеческие и мышиные линии раковых клеток с помощью регулируемых тетрациклином конструкций. Содержащие данные конструкции клетки отбирали и выращивали in vitro и in vivo в таких условиях, при которых интересующий ген экспрессировался или оставался молчащим.
С помощью такого подхода было проанализировано 16 генов локуса Зр21.3 . Восемь генов ( TCEA1 , MLH1 , RHOA , ЗРК , PL6 , 101F6 , BLU и TGFBR ) не оказывали никакого влияния на клеточные линии. Шесть генов ( RBSP3 , NPRL2/G21 , RASSF1A , RASSF1C , SEMA3F и SEMA3F ) оказывали выраженное ингибирующее действие как in vivo, так и in vitro. Два гена - HYAL1 и HYAL2 - оказывали сильное ингибирующее действие в условиях in vivo в мышах SCID, но не в условиях in vitro, о чем судили по ингибированию образования колоний и по кривой роста. Результат типичного эксперимента с HYAL1 представлен на рис. 3 . Ген VHL1 также подавлял развитие опухоли in vivo, но не in vitro.
Возможно, существуют и другие, пока еще неидентифицированные гены-супрессоры опухоли с аналогичным асимметричным ингибирующим действием. Например, ген DEC1 (делетированный при сквамозно-клеточной карциноме пищевода, ESCC), расположенный в локусе 9q32-q34 , также может относиться к этой категории. Он сильно снижает канцерогенность клеток ESCC в голых мышах, но проявляет лишь слабую ингибирующую активность в условиях in vitro [ Yang, 2005 ].
Потеря гетерозиготности (LOH), часто встречающаяся в большинстве случаев рака у человека и не связанная с какими-либо известными на сегодня генами-онкосупрессорами, а также существование "кластеров генов-онкосупрессоров", как тот, что был обнаружен на плече человеческой хромосомы Зр [ Weaver, 1997 ], ставят вопрос о возможном наличии корегуляции и очерчивают перспективную область дальнейших исследований.
