ДНК: заузливание
Заузливание ДНК - процесс образования узлов при циклизации ДНК. При замыкании линейной молекулы ДНК в кольцо она оказывается в определенном топологическом состоянии, незаузленном или отвечающем узлу определенного типа . В случае двойной спирали ДНК речь должна идти о типе узла, образуемого осью двойной спирали (незаузленную замкнутую цепь принято называть тривиальным узлом). При всех конформационных перестройках цепей тип узла должен сохраняться. Это обстоятельство для замкнутых цепей должно сказываться на их конформационных свойствах, которые должны зависеть, вообще говоря, от их топологии.
Все опубликованные в литературе данные о зависимости вероятности образования узла при случайном замыкании цепи от числа статистических сегментов в ней, n, собраны вместе на Рис. Зависимость вероятности образования узла от числа сегментов . Результаты, полученные разными авторами, очень хорошо согласуются между собой. Это не удивительно, так как несмотря на некоторые отличия в использованных моделях полимера, которыми и обусловлены небольшие различия в результатах, приведенные данные относятся к модели бесконечно тонкой полимерной цепи. Из этого рисунка видно, что вероятность образования узла имеет явную тенденцию стремиться к единице при увеличении n, хотя пока удалось провести расчеты только до таких n, при которых эта вероятность едва превысила 0,5. В работах Вологодский А.В. и др., 1974b и Frank-Kamenetskii M.D. ea, 1975 приведены также данные о вероятности образования узлов различных типов для модели бесконечно тонкой цепи.
Вероятность образования заузленной цепи чрезвычайно резко падает при увеличении отношения толщины сегмента d к его длине l0 ( Le Bret M., 1980 и Klenin K.V. ea, 1988 ). Как показали расчеты ( Klenin K.V. ea, 1988 ), влияние толщины цепи настолько велико, что им нельзя пренебрегать даже для такой молекулы, как двойная спираль ДНК. Результаты этих расчетов представлены на Рис. Зависимость вероятности образования узла от отн. d/l(0) . Как видно из рисунка, вероятность образования узла падает почти в 10 раз при увеличении отношения d/l0 от 0,02 до 0,1. Из этих результатов следует, что экспериментальное исследование зависимости доли заузленных молекул ДНК, получающейся при их случайной циклизации в растворе, от ионных условий может оказаться наиболее чувствительным методом для определения эффективного диаметра двойной спирали.
Впервые заузленные молекулы ДНК были обнаружены в препаратах однонитевых кольцевых ДНК после их обработки топоизомеразой типа I ( Liu L.F. ea, 1976 ). Это был первый случай обнаружения заузленных полимерных цепей.
Заузленные молекулы ДНК были выделены из клеток E.coli ( Shishido K. ea, 1987 ). Было показано, что в диком штамме клеток около 1% ДНК плазмиды pBR322 выделяется в форме узла 31. В штаммах, несущих мутации по генам ДНК-гиразы, количество заузленных ДНК достигает 10%. Скорее всего узлы препятствуют нормальному функционированию ДНК в клетке, однако некоторая доля заузленных молекул возникает в процессе репликации ДНК, а в функции топоизомераз входит "развязывание" этих узлов. Поэтому доля заузленных молекул в мутантных по ДНК-гиразе клетках оказывается выше.
Основными методами изучения топологии двунитевой ДНК являются электронная микроскопия и электрофорез в геле. На обычной электронно - микроскопической фотографии ДНК, однако, довольно трудно анализировать топологию молекул, так как трудно судить о том, какая из нитей в точках их пересечения на подложке идет выше, а какая ниже. В значительной мере эту трудность удалось впервые преодолеть за счет связывания двойной спирали с белком recA ( Krasnow M.A. ea, 1983 ). При этом нить ДНК утолщается настолько, что структура пересечений сегментов ДНК на фотографиях хорошо просматривается. С другой стороны, заузленные молекулы ДНК отличаются по подвижности в геле от незаузленных, что позволяет разделять их при гельэлектрофорезе (смотри обзор Wasserman S.A. and Cozzarelli N.R., 1986 ). Этот метод требует специальной калибровки, так как заранее нельзя сказать, какое положение в геле должна занимать та или иная топологическая структура относительно незаузленной кольцевой формы ДНК. В настоящее время, однако, уже накоплен достаточно большой экспериментальный материал о подвижности различных топологических структур относительно незаузленных топоизомеров исследуемой ДНК. Так, в работе Liu L.F. ea, 1980 , где впервые наблюдались заузленные двунитевые молекулы ДНК, было показано, что подвижность трилистников соответствует подвижности незаузленной кольцевой замкнутой формы этой же ДНК с тремя сверхвитками. При исследовании этим методом заузленных молекул ДНК они должны содержать однонитевые разрывы, так как иначе подвижность будет зависеть и от порядка зацепления нитей двойной спирали. Важные достоинства электрофоретического метода состоят в его простоте по сравнению с электронной микроскопией и возможностью проводить количественные измерения доли тех или иных структур. Естественно, что с помощью электрофореза в геле нельзя различить заузленные молекулы ДНК, представляющие собой зеркальные стереоизомеры. Здесь электронномикроскопический подход является единственным. С его помощью было показано, что образуемые с помощью топоизомеразы типа II трилистники поровну распределены между левыми и правыми стереоизомерами ( Krasnow M.A. ea, 1983 ).
