Циклизация ДНК
Циклизация ДНК - процесс образования кольцевой формы ДНК из линейной. Для циклизации необходимо, чтобы концы линейных молекул ДНК могли воссоединяться и фиксироваться в таком состоянии. Фиксирование может происходить за счет ферментативного образования ковалентных связей между 3'- и 5'-концами цепей ДНК, катализируемого ферментом ДНК- лигазой. Эффективность реакции значительно возрастает, если молекулы ДНК имеют так называемые липкие концы (смотри Рис. Липкие концы ДНК фага лямбда ). Липкие концы существуют у ряда природных фаговых ДНК. Более короткие липкие концы могут возникать в результате действия рестриктаз на кольцевые молекулы ДНК. При слипании таких концов происходит образование комплементарных пар и они удерживаются в связанном состоянии некоторое время даже без образования ковалентных связей. Время их развала в очень сильной степени зависит от числа образуемых при слипании пар оснований, а также от условий в растворе. В том случае, если длина липких концов превышает 10 нуклеотидов, молекулы могут оставаться в воссоединенном состоянии в течение десятков часов и более.
Термодинамика и кинетика образования такой кольцевой формы молекулами ДНК, длина которых 30-50 тысяч пар оснований, была подробно изучена ( Wang J.C. and Davidson N., 1966a , 1966b , 1968 и Wang J.C., 1967 ). Изменение свободной энергии молекулы при переходе из линейной формы в кольцевую, D Fc, складывается из уменьшения конформационной энтропии всей цепи при замыкании ее концов (и возникновения упругих напряжений в двойной спирали в случае очень коротких молекул ДНК), а также изменения свободной энергии липких концов при образовании ими спиральной структуры
D Fc = сумма D Fi - RT *ln[Pc*p0] (1),
i где через D Fi обозначено изменение свободной энергии липких концов при образовании ими двойной спирали из одноцепочечного состояния ( переход клубок-спираль ), Pc - вероятность попадания одного из концов цепи в малый объем v в окрестности другого конца. Для свободно-сочлененной цепи длиной L вероятность Pc равна
Pc = [ 3/(2 p l0 *L)]3/2 * v (2),
где через l0 обозначена длина статистического сегмента цепи. Хотя объем v нельзя определить независимым способом, формула (2) предсказывает определенную зависимость Pc от L. Соотношение (1) было проверено экспериментально ( Wang J.C. and Davidson N., 1966a ). Для ДНК фага l была определена константа скорости циклизации при различных температурах и концентрациях ионов натрия. При [Na+] = 0,13М для константы скорости циклизации k выполняется следующее соотношение:
k = 3*1013 * exp(-24000/RT) мин.-1 (3).
Вблизи от интервала перехода между линейной и кольцевой формами характерные времена релаксации рассматриваемого процесса, определяемые этой константой, измеряются десятками минут. Скорость циклизации сильно зависит от размеров липких концов.
При количественных исследованиях циклизации часто используют сопоставление реакции циклизации с димеризацией той же ДНК. В растворе наряду с процессом циклизации исходных цепей всегда идет образование линейных и кольцевых димеров, тримеров и т.д.( Jacobson H. and Stockmayer W.H., 1950 ). Образование линейных димеров характеризуется определенными константами скорости и равновесия для соответствующей бимолекулярной реакции. Отношение константы скорости циклизации к константе скорости образования димеров, равное отношению констант равновесия соответствующих процессов, наывается J-фактором. В случае достаточно длинных цепей, размеры которых превышают несколько куновских сегментов, J-фактор равен просто концентрации одного конца молекулы вблизи другого, (3/(2 p l0*L))3/2.
Формула (2) правильно описывает вероятность сближения концов для цепей, состоящих более чем из тысячи пар нуклеотидов. Для описания конформационных свойств более коротких молекул следует использовать не свободно-сочлененную модель , а персистентную модель . Кроме того, для таких коротких молекул оказывается существенной зависимость распределения торсионной ориентации концов от длины ДНК ( Shore D. and Boldwin R.L., 1983 ). Распределение торсионной ориентации концов должно иметь то же среднее значение и ту же ширину, что и равновесное распределение той же ДНК по топоизомерам . Однако в отличие от распределения по топоизомерам, оно является не дискретным, а непрерывным. И лишь узкие области этого непрерывного распределения, отвечающие целочисленным значениям Lk , соответствуют торсионной ориентации, в которой может произойти химическая сшивка концов (смотри Рис. J-фактор линейных молекул ДНК в зависимости от их длины ). При этом возможны две качественно различные ситуации, характерные для достаточно длинных и совсем коротких ДНК. Если ширина распределения торсионной ориентации концов много меньше 360 градусов, то смещение центра этого распределения за счет изменения длины ДНК (положение центра определяется средним суммарным углом спирального вращения нитей двойной спирали и смещается приблизительно на 34 градуса при изменении длины на одну пару оснований) должно сильно изменить суммарную вероятность ориентаций, в которых может произойти циклизация. Наибольшая вероятность циклизации будет, естественно, отвечать тем длинам молекул, для которых максимум распределения соответствует подходящей для замыкания торсионной ориентации концов, т.е. когда величина 34N/360 близка к целому числу. В том же случае, когда ширина распределения значительно больше 360 градусов, смещение его центра не изменит существенно вероятность ориентаций, подходящих для замыкания. Первая ситуация отвечает молекулам ДНК длиной до 1000 пар оснований, вторая - молекулам из 1000 и более пар. Периодические колебания зависимости скорости циклизации от длины молекул, обусловленные влиянием торсионной ориентации, для коротких ДНК оказываются крайне существенными ( Рис. Зависимость J-фактора от длины для молекул ДНК 237-254 пар ).
