ДНК-Топоизомеразы и конформация ДНК

Топоизомеразы [Drlica, K. 1984 и Gellert, M. 1981] - ферменты, способные менять топологическое состояние кольцевых ДНК путем создания временного однонитевого или двунитевого разрыва в молекуле ДНК, проведения сквозь разрыв другого, целого сегмента цепи и воссоединения цепи в месте разрыва. В результате такого ферментативного акта целостность цепей сохраняется, но их топологическое состояние может измениться.

Топоизомеразы необходимы в клетке для решения различных топологических проблем, возникающих при репликации и транскрипции кольцевых замкнутых ДНК. Кроме того, они обеспечивают поддержание определенного уровня сверхспирализации ДНК в клетке, по крайней мере в случае простейших.

По механизму действия топоизомеразы делятся на два типа: I и II. Первая топоизомераза, относящаяся к типу I, была открыта в 1969 г. ( Wang J.C., 1971 ). В настоящее время топоизомеразы типа I найдены почти во всех классах живых организмов. В ходе своей работы топоизомеразы типа I вносят разрыв лишь в одну из цепей двойной спирали. Топоизомеразы типа I из прокариотических клеток способны вызывать релаксацию отрицательно, а из эукариотических - иногда и положительно сверхспирализованной кольцевой замкнутой ДНК. Для своей работы они не требуют никаких кофакторов. Внося разрыв в одну из цепей двойной спирали, фермент ковалентно пришивается к одному из концов цепи, запасая в образованной связи энергию, необходимую для последующего воссоединения этой цепи.

Топоизомеразы I и II делают, соответственно, одноцепочечные и двуцепочечные разрывы. Топоизомераза I E.coli (сигма-протеин, тип 1) уменьшает суперспирализацию ДНК, в то время как топоизомераза II (ДНК-гираза, тип 2) увеличивает ее.Топоизомераза I - это полипептид, массой 101 килодальтон, кодируемый геном topA. ДНК-гираза состоит из двух субъединиц весом 105 и 95 килодальтон, кодируемых, соответственно, генами gyrA и gyrB, и имеет тетраметрическую структуру типа А2В2.

Топоизомеразы типа II в ходе своей работы рвут одновременно обе нити двойной спирали ДНК и проводят сквозь разрыв другой двунитевой сегмент. В ходе такой реакции порядок зацепления , Lk , а следовательно и число сверхвитков , должно изменяться на 2. Поэтому из определенного топоизомера топоизомераза типа II может сделать лишь топоизомеры , отличающиеся от исходного на четное число сверхвитков, что и было продемонстрировано экспериментально ( Brown P.O. and Cozzarelli N.R., 1979 и Liu L.F. ea, 1980 ). Почти для всех реакций, катализируемых топоизомеразами типа II, необходим сопряженный гидролиз АТР ( Gellert M., 1981 , Liu L.F., 1983 , Wang J.C., 1985 , Baldi M.I. ea, 1980 и Hsieh T.S. and Brutlag D., 1980 ). Именно он делает возможной реакцию сверхспирализации кольцевой замкнутой ДНК, при которой происходит увеличение ее свободной энергии .

Топоизомеразы способны не только вызывать изменение сверхспиральной плотности кольцевой замкнутой ДНК, но и катализировать другие процессы, в которых меняется топология цепей ДНК. Было показано, что топоизомеразы типа II способны катализировать реакцию образования заузленных двунитевых кольцевых ДНК , а также реакцию образования зацеплений нескольких молекул. Равновесие в реакциях можно сдвигать в ту или другую сторону в зависимости от условий опыта.

Узлы и зацепления в двунитевых ДНК могут образовываться и при действии топоизомераз типа I при условии, что в кольцевых ДНК имеются однонитевые разрывы ( Tse Y.C. and Wang J.C., 1980 и Brown P.O. and Cozzarelli N.R., 1981 ). При этом фермент связывается с ДНК в точке однонитевого разрыва и производит разрыв в другой цепи, сквозь который проходит сегмент двойной спирали.

Икеда и др. показали, что ДНК гираза может способствовать незаконной рекомбинации . Инкубация плазмиды pBR322 и фага лямбда в экстракте клетки E.coli привела к формированию рекомбинантов лямбда-pBR322 [ 129 ]. Добавление оксолиновой кислоты (ингибитора ДНК гиразы, которая воздействует на субъединицу А), стимулировало рекомбинацию. Стимуляция не наблюдалась у гиразы из клеток Nal(r), субъединица А которой резистентна к оксолиновой кислоте. Добавление очищенной ДНК-гиразы к экстракту также стимулировало реком- бинацию [ 130 ]. Было предположено, что две А-субъединицы каждой тетрамерической молекулы гиразы ковалентно связываются с ДНК и эти две тетрамерические молекулы гиразы, одна связанная с ДНК фа- га лямбда, другая с ДНК pBR322, кратковременно ассоциируют в ок- тамерический комплекс. Диссоциация октамера в тетрамеры сопровож- дается обменом между одной из двух А-субъединиц и нитями ДНК, прикрепленными к этим субъединицам. Сшивание разрыва после высво- бождения гиразы генерирует рекомбинантную молекулу ДНК [ 127 ].

Одним из предположений, следующих из данной модели является то, что новые стыки, созданные гиразой должны соответствовать известным сайтам , по которым гираза расщепляет ДНК. К сожалению, они оказались существенно вырожденными. Опубликованны консенсусные последовательности , определенные in vitro [ 198 , 199 ] и in vivo [ 175 ] как YRT^GNYNNY и NRT^GRYCKY, соответственно (знак "^" указывает позицию расщепления). Консенсус стыков рекомбинантов pBR322-лямбда, выделенных из клеточных экстрактов, NRT^RNNYNY [ 206 ], лишь слабо пересекается с консенсусами гиразных сайтов ра- зрыва. Аналогично, стыки рекомбинантов pBR322-лямбда, полученных in vivo, имели лишь слабую гомологию с этим консенсусом [ 187 ]. Тем не менее, направленные тесты показали, что три из пяти рекомбинационных сайтов лямбда-pBR322 сшиты ДНК гиразой in vitro [ 128 ], что говорит в пользу данной модели.

Другим выводом из данной модели является то, что гираза в одиночку может взять на себя выполнение целиком всего процесса рекомбинации. Этого не наблюдалось с очищенной гиразой E.coli, так как для протекания реакции помимо фермента требовался клеточ- ный экстракт [ 130 ]. Противоположный результат был получен с фер- ментом типа 2 (топоизомеразой фага T4), который также является мультипротеиновым комплексом. Инкубация генетически меченой лямбда-ДНК с очищенным ферментом в отсутствие кле- точного экстракта привела к появлению рекомбинантов, отличающихся от родительских геномов наличием делеции или дупликации [ 126 ]. Эти результаты поддерживают, но окончательно не подтверждают

-2 постулированную модель. Частота рекомбинации (порядка 10 ) была слишком мала, чтобы позволить прямое выявление рекомбинантов, и они были зафиксированы только после введения ДНК, обработанной T4-топоизомеразой, в клетки E.coli. Возможность того, что топо- изомераза не выполняет целиком рекомбинационный процесс, а только включает его посредством нанесения рекомбиногенных повреждений, следовательно, не совсем исключается.

Топоизомеразы типа I, возможно, вызывают изменчивость генома у эукариот . Эти ферменты могут разрезать одноцепочечную ДНК в районах с потенциалом к внутрицепочечному спариванию [ 20 ] и ос- таются связанными с 3'- концом. Они могут присоединять этот конец к 5'- концу одноцепочечной или двуцепочечной ДНК [ 19 , 107 ]. Короткие последовательности, вовлеченные в вырезание провируса SV40 из генома клеточной линии крысы [ 34 ], похожи на сайты узнавания топоизомеразы [ 73 ],также некоторые сайты вырезания SV40 совпадают с сайтами, по которым топоизомераза режет in vitro [ 33 ].

Ссылки:

Все ссылки