ДНК: плотность сверхвитков
Плотность сверхвитков, s, - количественная характеристика сверхспирализации ; плотность сверхвитков равна числу сверхвитков , тау, нормированному на длину кольцевой ДНК. Этот параметр определяется соотношением
s = g*t/n (1),
(где g - количество нуклеотидов, приходящееся на один виток двойной спирали ДНК, n - число пар оснований в молекуле ДНК), и равен отношению числа сверхвитков к числу витков двойной спирали, находящейся в релаксированном состоянии.
Выделенные из клетки молекулы кольцевой замкнутой ДНК почти всегда имеют отрицательную сверхспирализацию. Значения s для разных плазмид, фаговых, вирусных и митохондриальных ДНК животных лежат обычно в интервале от -0,03 до -0,1 ( Bauer W.R., 1978 ). Плотность сверхвитков выделенной из клеток ДНК в сильной степени варьирует (s = -0,03 * -0,09) даже для плазмидных и фаговых ДНК, растущих в одном хозяине - клетках E. coli.
Распределение по топоизомерам в выделенной из клеток ДНК является достаточно широким ( Shure M. ea, 1977 ). С хорошей точностью оно описывается Гауссовой функцией распределения
2 2
P(t) = А*exp[ -(t - t0) /2r ] (2),
где через A обозначен нормировочный множитель, t0 - среднее
2 число сверхвитков в данном препарате, r - дисперсия распределения. Для ДНК, состоящей из 5000 пар оснований, в выделенном препарате в сравнимых количествах присутствует около 10 различных топоизомеров.
Среднее значение t0 и ширина распределения молекул по t зависят от условий жизни клеток, из которых выделялась данная ДНК. Так, ширина распределения по топоизомерам плазмидной ДНК, выделенной из клеток E. coli, находящихся в логарифмической стадии роста, значительно меньше, чем у ДНК, полученной из тех же клеток, но находящихся в стационарной фазе. Средняя плотность сверхвитков выделенной из клеток плазмидной ДНК зависит от температуры,при которой выращивались клетки ( Mirkin S.M. ea, 1984 и Goldstein E. and Drlica K., 1984 ).
Плотность сверхвитков зависит от условий в растворе. При увеличении температуры двойная спираль раскручивается, причем температурный коэффициент изменения плотности сверхвитков равен
-4 -1
D s/D T = 3.1*10 град . Как правило, увеличение ионной силы раствора приводит к увеличению отрицательной сверхспирализации, т.е. двойная спираль закручивается. Для одновалентных ионов Na+, K+, Li+ и NH4+ в интервале их концентраций от 0,05 до 0,3 М
-3
D s/D pX+ = 4,5*10 .
В настоящее время существует два принципиально различных метода определения числа сверхвитков и, следовательно, плотности сверхвитков в препарате кольцевой замкнутой ДНК. Первый метод основан на титровании сверхвитков интеркалирующим красителем и применим лишь для отрицательно сверхспирализованной КЗ ДНК, второй - на одно- и двумерном гель-электрофорезе .
Для получения ДНК с заданной плотностью сверхвитков молекулы ДНК, находящиеся в КЗ форме, обрабатывают топоизомеразой I, в результате чего величина Lk ( порядок зацепления ) релаксирует к ее равновесному для данных условий значению. Это равновесное значение можно менять в широких пределах путем добавления в раствор различных лигандов, которые при связывании с ДНК изменяют угол спирального вращения двойной спирали. Так, добавляя различное количество интеркалирующего в ДНК красителя , можно получить после обработки ферментом и удаления лиганда и фермента из раствора кольцевую замкнутую ДНК с требуемой отрицательной сверхспирализацией.
