Электрофорез двумерный
Двумерный гель-электрофорез - модификация метода одномерного гель-электрофореза , увеличивающая его разрешение, а также позволяющая исследовать неканонические структуры, возникающие в сверхспирализованной молекуле кольцевой ДНК.
Схематически этот метод (предложенный в Lee C.-H. ea, 1981 ) выглядит следующим образом. В один из углов плоского геля наносится препарат кольцевой замкнутой ДНК, состоящий из смеси топоизомеров, и проводится электрофорез вдоль одной из сторон геля. После этого гель насыщается интеркалирующим в ДНК лигандом , связывание которого с кольцевой замкнутой ДНК вызывает частичную релаксацию напряжения сверхспирализации . Подвижность топоизомеров теперь будет определяться не величиной t тау (число сверхвитков), а значением
(t - N*n*f/360), (1) где n - число связанных молекул лиганда в расчете на пару оснований, f - угол раскручивания двойной спирали при связывании одной молекулы лиганда (f меньше или равно 0), N - число пар оснований в ДНК. Это значение можно рассматривать как эффективное число сверхвитков . Проведя теперь электрофорез в перпендикулярном направлении, мы получим картину, представленную на Рис. Двумерный гель-электрофорез ДНК pBR322 .
Выбрав соответствующим образом концентрацию лиганда в геле, можно добиться того, что топоизомеры, имевшие одинаковую подвижность до связывания с лигандом, будут хорошо разрешаться. Число топоизомеров с t меньше или равно 0, которые удается разделить по подвижности, увеличивается при использовании двумерного электрофореза по сравнению с одномерным почти вдвое. Кроме того, в этом случае топоизомеры с положительными сверхвитками отличаются по положению на электрофореграмме от топоизомеров с тем же числом отрицательных сверхвитков.
Двумерный гель-электрофорез - эффективный метод исследования локальных конформационных изменений , происходящих под влиянием отрицательной сверхспирализации Wang J.C. ea, 1983 . Он позволяет в результате одного эксперимента получить полную зависимость вероятности конформационного перехода от плотности сверхвитков . Кроме того, он дает важную информацию об изменении равновесного числа оборотов одной нити ДНК относительно другой , сопряженном с этим переходом. При обыкновенном одномерном гель-электрофорезе подвижность молекул монотонно увеличивается с ростом абсолютного числа сверхвитков. Это связано с тем, что топоизомеры с большим числом сверхвитков должны обладать большим райзингом и, следовательно, иметь более компактную конформацию. Однако это справедливо лишь до тех пор, пока в данной молекуле не происходит никаких конформационных переходов, которые уменьшают напряжение сверхспирализации и, следовательно, абсолютное значение райзинга. Топоизомеры, в которых произошел переход, будут обладать меньшей подвижностью, чем та, которую они имели бы в отсутствие конформационных изменений. В результате монотонное увеличение подвижности молекул с ростом числа сверхвитков может оказаться нарушенным. При этом на электрофореграмме смеси топоизомеров возникает картина нерегулярно расположенных полос, которые трудно соотнести с определенными топоизомерами. Для того, чтобы провести соотнесение полос на такой "беспорядочной" электрофореграмме определенным топоизомерам и используется двумерный гель-электрофорез. Концентрация интеркалирующего в ДНК лиганда, которым насыщается гель перед проведением фореза во втором направлении, подбирается таким образом, чтобы оставшегося напряжения сверхспирализации было недостаточно для образования неканонической структуры ни в одном топоизомере. Поэтому после проведения фореза во втором направлении, перпендикулярном первому, легко провести соотнесение пятен отдельным топоизомерам. Скачкообразное уменьшение подвижности топоизомеров в результате кооперативного перехода участка ДНК в неканоническую структуру получает наглядное проявление.
На Рис. Двумерный гель-электрофорез ДНК pBR322 со вставкой представлен пример электрофореграммы смеси топоизомеров той же ДНК pBR322 со вставкой d(CG)16*d(CG)16, переходящей в неканоническую структуру под влиянием отрицательной сверхспирализации ( Wang J.C. ea, 1983 ). Подвижность топоизомеров этой ДНК при форезе в вертикальном направлении испытывает скачок между 17-м и 18-м номерами, как становится видно после проведения фореза во втором направлении. Скачок подвижности связан, очевидно, с образованием какой-то неканонической структуры во вставке, что приводит к уменьшению напряжения сверхспирализации, уменьшению абсолютной величины райзинга и, следовательно, подвижности ДНК.
Кроме интервала плотности сверхвитков, в котором происходит переход участка ДНК в неканоническую структуру, из такой электрофореграммы можно извлечь еще одну крайне важную информацию. Для каждого топоизомера можно определить среднее изменение равновесного кручения одной нити вокруг другой в результате перехода, обозначаемое, обычно, через D Tw. Как видно из Рис. Двумерный гель-электрофорез ДНК pBR322 со вставкой , подвижность 20-го топоизомера при форезе в первом направлении оказывается почти равной подвижности 14-го. Следовательно, у этих топоизомеров должен быть одинаковый райзинг, а, значит, и одинаковое напряжение сверхспирализации. Образование неканонической структуры не должно было существенно изменить общую торсионную жесткость ДНК, так как переход затрагивает очень небольшую долю всех пар оснований ДНК. Это означает, что при одинаковом напряжении сверхспирализации отклонение кручения нитей от равновесного значения также должно совпадать. Следовательно, все различие в числе сверхвитков компенсируется у этих топоизомеров изменением равновесного кручения при переходе. Так, для 20-го топоизомера (t = -15,7) среднее уменьшение равновесного кручения составляет примерно 5,7 витка (его подвижность соответствует "топоизомеру с номером 14,3"). На Рис. Зависимость изменения кручения ДНК от числа сверхвитков приведена зависимость D Tw от t, построенная на основании рассматриваемой электрофореграммы. При этом предполагалось, что положения топоизомеров 13 - 16 на электрофореграмме можно использовать как реперные точки, позволяющие определить D Tw для топоизомеров с номерами 17 - 21. Как видно из Рис. Зависимость изменения кручения ДНК от числа сверхвитков , полное изменение D Tw в результате перехода составляет 5,7 витка. Это однозначно указывает на то, что вставка d(CG)16-d(CG)16 переходит в условиях опыта в левоспиральную Z-форму , а не в крестообразную структуру .
Наблюдаемая в эксперименте величина D Tw для данного топоизомера является средним значением изменения кручения за время электрофореза. Поэтому в том случае, если время релаксации для образования неканонической структуры превышает время электрофореза, некоторые топоизомеры могут присутствовать на электрофореграмме в виде двух пятен, отвечающих наличию или отсутствию неканонической структуры. Действительно, такая ситуация наблюдается в случае крестообразных структур, времена релаксации которых могут составлять десятки часов и более ( Lyamichev V.I. ea, 1983 ).
Из Рис. Двумерный гель-электрофорез ДНК pBR322 со вставкой , следует, что для интерпретации опытов по двумерному электрофорезу препарат ДНК должен содержать широкий набор топоизомеров, включающий как молекулы с t больше или равно 0, так и молекулы, в которых образовалась изучаемая неканоническая структура. Метод двумерного электрофореза накладывает ограничение на величину плотности сверхвитков, при которой происходит исследуемый конформационный переход, так как для того чтобы скачок подвижности можно было наблюдать на электрофореграмме, в области конформационного перехода изменение подвижности топоизомеров в первом направлении не должно выходить на насыщение. ДНК: H-форма
