ДНК: крестообразные структуры
Крестообразные структуры - структуры, состоящие из двух шпилек на регулярной двойной спирали ДНК. Пример крестообразной структуры приведен на Рис. Шпилька и крестообразная структура . Такие структуры, в которых шпильки состоят из цепей с разной последовательностью, не встречаются в природных молекулах ДНК и могут быть получены лишь искусственно. Они являются стабильными и точка скрещивания в таких структурах жестко определена последовательностью. В природных двунитевых ДНК часто встречаются так называемые палиндромные последовательности, обладающие осью симметрии второго порядка и способные образовывать симметричные крестообразные структуры (смотри Рис. Крестообразная и линейная формы палиндрома ДНК ColE1 ).В этих крестообразных структурах точка скрещивания может смещаться за счет изменения размера шпилек. Палиндромные области могут быть несовершенными, и в этом случае в шпильках крестообразной структуры должны появляться некомплементарные пары оснований или вытолкнутые из спиральных областей основания. В линейной ДНК крестообразная структура палиндромных областей является термодинамически невыгодной по сравнению с регулярной двунитевой формой и может наблюдаться в некоторых случаях лишь как метастабильное состояние. Устойчивые крестообразные структуры в палиндромных областях возникают лишь в кольцевых ДНК.
Образование крестообразных структур в природных кольцевых ДНК было открыто в 1980 г. Лилли ( Lilley D.M.J., 1980 ) и почти одновременно Уэллсом с сот. ( Panayotatos N. and Wells R.D., 1981 ). В своей пионерской работе Лилли исследовал ДНК фага fХ174 и плазмид ColE1 и pBR322 и во всех трех ДНК обнаружил образование крестообразных структур, причем в ДНК pBR322 такие структуры образовывались с разной степенью эффективности в трех различных палиндромах. Размеры всех палиндромных областей, в которых были зарегистрированы крестообразные структуры, оказались довольно близки. Они отвечали образованию 9 - 13 пар оснований в спиральных областях каждой из шпилек креста , а петли шпилек состояли из 3- 5 оснований. Аналогичные результаты тем же методом нуклеазного зондирования были получены в лаборатории Уэллса. Как показал теоретический анализ, подобные крестообразные структуры должны возникать и в других фаговых и плазмидных ДНК ( Vologodskii A.V. and Frank-Kamenetskii M.D., 1982 ).
В работе ( Lyamichev V.I. ea, 1983 ) для исследования образования крестообразных структур был успешно применен метод двумерного гель-электрофореза . Полученная электрофореграмма разделения смеси топоизомеров плазмиды pАО3 представлена на Рис. Двумерный электрофорез ДНК pАО3 . Эта ДНК представляет собой 1/4 часть плазмиды ColE1, включающей ее главный палиндром. Из рисунка видно, что переход происходит между 9-м и 11-м топоизомерами, что отвечает плотности сверхвитков около -0,06. В этой работе было впервые обнаружено, что время релаксации при образовании крестообразных структур может составлять десятки часов или более. В самом деле, 10-й топоизомер виден на электрофореграмме в виде двух пятен, соответствующих молекулам с крестом и без креста (см. рис.). Следовательно, за время фореза, которое составляет около 20 часов, конформационное состояние палиндромной области в большей части молекул этой группы не менялось (в противном случае они оказались бы между двумя крайними положениями этого топоизомера на электрофореграмме).
Появление количественных исследований образования крестообразных структур дало возможность проанализировать, в какой степени этот процесс соответствует существующим теоретическим представлениям, а также уточнить характеризующий его энергетический параметр. Из двух энергетических параметров, энергии границы Fj и изменения энергии пары оснований при переходе D F, в случае крестов величина D F должна быть принята равной нулю. Действительно, увеличение размера креста происходит за счет разрушения двух пар оснований в основной спирали и образования двух таких же пар в шпильках креста. Это не должно изменить свободную энергию структуры, так как при этом сохраняется число спаренных оснований и все ее граничные элементы. Следовательно, образование крестообразных структур должно характеризоваться одним энергетическим параметром Fj (физический смысл в данном случае имеет лишь величина 2Fj).
Основное соотношение, связывающее точку перехода str палиндрома из n звеньев в крестообразную структуру со свободной энергией образования этой структуры, 2F(j) , имеет вид (смотри Термодинамический анализ образования неканонических структур ):
str= Fj/(A*m*k) + n/(2N) (1)
При написании (1) было учтено то, что для крестообразных структур параметр k равен 1. В самом деле, при их образовании происходит полное раскручивание соответствующего участка B-ДНК , а в крестообразной структуре нити не закручены друг относительно друга galt = бесконечность). Параметр A согласно имеющимся в настоящее время данным полагается равным 10RT для всех ионных условий. Соотношение (1) описывает переход лишь в том случае, если n меньше или равно m0, т. е. весь палиндром переходит в крест как целое. Для оценки m0 нужно знать параметр 2Fj.
Оценим параметр 2Fj из экспериментальных данных, представленных на Рис. Двумерный электрофорез ДНК pАО3 . Характер электрофореграммы показывает, что весь палиндром переходит в крестообразную структуру как целое - все изменение равновесного кручения ДНК , D Tw, происходит в узком интервале значений s. Поэтому для определения 2Fj можно воспользоваться соотношением (1). Палиндром ДНК pAO3, в котором происходит образование крестообразной структуры, состоит из 31 пары оснований, а длина всей ДНК составляет 1683 пары оснований ( Lyamichev V.I. ea, 1983 ). Поэтому из соотношения (1) находим (учитывая, что str = -0,06), что 2Fj = 21 ккал/моль. Найденное значение 2Fj можно использовать для оценки предельного размера палиндромной области, которая еще будет переходить в крест как целое:
;m0 = ! 2N*Fj/A =~ ! 3N (2).
Из (2) следует, что переход почти во всех случаях природных палиндромов, длина которых, как правило, не превышает 40 пар оснований, будет полностью кооперативным .
Однако, образование крестообразных структур не всегда удовлетворительно описывается уравнением (1). Для палиндромов с последовательностями d(AT)n значение параметра 2Fj, которое можно определить из экспериментальных даннных, полученных в для нескольких палиндромов различной длины ( Panyutin I. ea, 1985 ), изменяется в пределах 3 ккал/моль. Это связано, по-видимому, с тем, что образование крестообразных структур приводит в ряде случаев к дополнительному раскручиванию ДНК по сравнению с ожидаемым. Анализ данных работ ( Panyutin I. ea, 1985 , Lyamichev V.I. ea, 1983 , Courey A.J. and Wang J.C., 1983 , Naylor L.H. ea, 1986 , Greaves D.R. ea, 1985 ) показывает, что для разных палиндромов, образующих крестообразные структуры с 3 - 5 основаниями в петлях шпилек, параметр 2Fj варьирует от 15 до 21 ккал/моль. Такие изменения в величине 2Fj приводят к тому,что возможно в общем случае предсказать плотность сверхвитков , при которой происходит образование крестообразных структур, лишь с точностью до 0,01.
В ряде работ исследовалось влияние внешних условий на образование крестообразных структур ( Singleton C.K., 1983 , Panyutin I. ea, 1984 ). При приближении к температуре плавления линейной ДНК вероятность образования крестообразных структур должна падать за счет образования раскрытых участков, которое должно приводить к сбросу напряжения сверхспирализации ( Vologodskii A.V. and Frank-Kamenetskii M.D., 1982 ). На опыте, однако, исчезновение крестообразных структур при повышении температуры наблюдается значительно раньше, чем следует ожидать появления раскрытых участков ( Panyutin I. ea, 1984 ). Видимо, в конкуренцию вступают какие-то другие структуры, образование которых стимулируется повышением температуры. Этот вывод косвенно подтверждается тем, что протяженный палиндром, переход в котором наблюдается при низкой плотности сверхвитков str = -0,03), образует крестообразную структуру и при 65 градусах Цельсия ( Courey A.J. and Wang J.C., 1983 ) - образование конкурирующих структур менее вероятно при такой низкой сверхспиральной плотности.
В работе ( Naylor L.H. ea, 1986 ) было проведено исследование влияния концентрации ионов Na+ и Mg2+ на точку перехода в крестообразную форму ряда природных палиндромных последовательностей. Полученные результаты показывают, что в целом уменьшение концентрации ионов в растворе приводит к уменьшению абсолютных значений str, при которых происходит переход. см. ДНК крестообразная структура
