Нестабильность палиндромов
Существование природных и успешное клонирование определенных искусственных палиндромов показало, что у бактерий могут существовать относительно короткие, близко лежащие инвертированые пов- торы. Например, 66-н.п. непрерывный палиндром (33-н.п. инвертированые повторы) [ 26], 48-н.п. палиндром, присутствующий в pUC7 [ 89], и синтетический 32-н.п. палиндром [ 170 ] могут, каждый в отдельности, размножаться в плазмидах E.coli. Некоторые более длинные палиндромы, как 147-н.п. палиндром из начала репликации SV40 или два синтетических палиндрома длиной 114 и 140 н.п., были также стабильны при размножении в плазмидах E.coli как с большим, так и с низким уровнем копий [ 25 ]. Палиндромы такого размера иногда бывают нестабильны: анализы ДНК показали, что палиндром длиной 68 н.п. из pBR322 был нестабилен в сайте pBR322 и в одном из пяти сайтов, проверенных в плазмидах, родственных R6K [ 51]. Более чувствительные генетические анализы выявили нестабильность палиндромов длиной 22-160 н.п. [ 46 , 59 ]. Более длинные палиндромы совсем нестабильны и влияют на жизнеспособность фага и плазмиды, в которой они находятся.
Общие наблюдения в ранних экспериментах по клонированию ДНК [ 40 , 45 ] заключались в том, что димерные плазмиды, состоящие из двух мономеров, лежащих "head to head" (инвертированые димеры), никогда не фиксировались в трансформированых бактериях. Такие молекулы ДНК были сгенерированы во время сшивки in vitro [ 88 , 194 ], что позволяет предположить, что длинные правильные палиндромы не устойчивы в бактериях, что подтверждается систематическим изучением нестабильности палиндромов [ 44 ].
Совершенные палиндромы длиной 1-3 kb были получены in vitro путем делеции центрального района и части последовательности IS50 из транспозона Tn5 , находящегося внутри гена Ap плазмиды pBR322. С использованием выделенных молекул было получено два типа транс- формантов. Меньшинство (от 12 до 35%) выявленных плазмид, несущих функциональный ген Ap, восстанавливались, предположительно,вслед- ствие рекомбинации между 9-н.п. повторами, фланкирующими Tn5. Оставшиеся трансформанты содержали плазмиды с укороченными палин- дромами, возникшими в результате делеций , влияющих на центральную часть инвертированых повторов. Как показано при анализе последо- вательностей трех плазмид[ 46 ] делеции получались при рекомбинации между короткими прямыми повторами (4-6 н.п.). Дальнейшие рекомби- нации 9-н.п. повторов, которые фланкируют оставшиеся последова- тельности Tn5, могли восстанавливать функциональный ген Ap во всех анализируемых плазмидах, хотя и с большим разбросом частот
-7 -2 (10 -10 ) [ 44 , 46 ]. Одной из возможных причин разнообразия была структура оставшихся инвертированых повторов (т.е. их длина и разнесение).Также была документально зафиксирована нестабильность правильных палиндромов, возникших в резудьтате делеции централь- ного района Tn5 [ 105 , 106 ].
Различные длинные палиндромы, не относящиеся к Tn5, возможно, также не несутся плазмидами, фагами и бактериальными хромосомами. Плазмиды, которые бы несли инвертированные повторы, составленные из 130-н.п. последовательности из pAT153 (плазмида, родственная pBR322) не могли быть сконструированы, хотя аналогичные плазмиды, несущие прямые повторы, можно получить достаточно легко [ 169 ]. Также были безуспешны попытки сконструировать другие палиндромы из различных последовательностей pAT153 [ 106 ]. Кроме того, палин- дром длиной 206 н.п., соответствующий терминальной последователь- ности MV (minute virus) мыши, был нестабилен, если находился в плазмидах E.coli, и подвергался делециям при рекомбинации между короткими прямыми повторами [ 27 ]. Далее,сконструированный in vivo фаг лямбда, несущий 3.2-kb палиндром, составленный из последова- тельностей фага, был нежизнеспособным [ 163 ]. Также, химерные фаги лямбда, несущие захлопывающиеся последовательности начала репли- кации человека длиной 200-500 н.п., не могли быть размножены в рекомбинированных клетках E.coli. Палиндром длиной 3.2 kb, вставленный в хромосому E.coli, был нестабилен, что подтверждает- ся получением беспалиндромного профага в результате лизогенизации E.coli фагом лямбда, несущим палиндром . Нестабильность палиндромов также была зафиксирована в бактериях, отличных от E.coli, так как палиндром, сгенерированый in vitro в pSM19035 подвергался делециям в Streptococcus pyogenes [ 21 ].
Длинные инвертированые повторы, разделенные центральным районом, могут стабильно поддерживаться в бактериях, что иллю- стрируется структурой многих транспозонов [ 146 ]. Длина централь- ного района, необходимого для стабилизации 1.9-kb палиндрома, которого несет плазмида, родственная pBR322, была установлена клонированием различных сегментов ДНК, имеющим длину 8-876 н.п., из его центра . Анализы ДНК 245 получившихся плазмид показал, что ни одна из них не имела вставок короче 57 н.п., и что только плазмиды со вставками длиннее 150 н.п. были стабильны.
Вероятно, длинные палиндромы летальны для любого репликона , несущего их. Летальность может быть следствием формирования стру- ктур типа шпилек путем внутринитевого спаривания,что,по-видимому, мешает репликации ДНК (такие структуры могут останавливать ДНК полимеразы [ 14 ]). Жизнеспособность репликонов может быть восстановлена в результате (i)делеции всего палиндрома [ 44 ], (ii) делеции центральной части палиндрома [ 46 ], или (iii) вставки сег- ментов ДНК в центр палиндрома. В получающихся репликонах процессы образования шпилек либо предотвращены, либо, вероятно, имеют существенные помехи. Первые два процесса, рассмотренные in vivo, являются следствием рекомбинации между короткими прямыми повторами.
