Выщепление транспозонов

Большинство транспозонных и инсерционных последовательностей генерируют короткие дупликации генома-мишени в сайте встраивания [ 124 ]. Рекомбинация между дупликациями удаляет вставленый элемент и одну из дупликаций. Этот процесс изучен наиболее глубоко для Tn5, Tn10 и фага Mu .

Транспозон Tn5 имеет длину 5.7 kb и содержит 1.5-kb терминальные инвертированные повторы , IS50, которые ограничивают центральный район, кодирующий устойчивость к канамицину [ 23 ]. Он дуплицирует последовательность длиной 9 н.п. в мишени во время инсерции [237]. Точное выщепление транспозона восстанавливает первоначальную последовательность мишени и может быть зафиксиро- вано на основе реверсии инсерционных мутантов. Изучение мутантных элементов показало, что для выщепления не требуется транспозаза [ 23 , 74 ]. Следовательно, выщепление не является отменой транспозиции (которая требует транспозазу) и, по-видимому, выполняется целиком хозяйскими функциями. Частота выщепления из различных сайтов очень сильно различается, для Tn5 она колеблется между 3*10-8 и 2*10 -4 , когда он находится в различных позициях гена lac плазмиды F' lac. Также было найдено, что большие (50 kb) инсерции элементов семейства Tn5 в Ap(r) ген pBR322 выщепляются (реверсия к Ap ) с частотой 1.4*10-10 - 2.5*10-7. Для совершенных палиндромов длиной 22, 32, или 90 н.п., полученных in vitro из этих исходных вставок [ 59 ] (палиндромы такой длины обычно не коррелируют с жизнеспособностью плазмид ; см. " Нестабильность палиндрома ") частота выщепления различается примерно в сто раз для одного и того же палиндрома в различных сайтах . Особенно значительно было 300-кратное различие в частоте выщепления палиндрома длиной 90 н.п. в паре смежных сайтов, перекрывающихся в 8 из 9 н.п.

Глобальная частота выщепления Tn5 была значительно уменьшена с 10 -6 до 10 -9 транспозоном, имеющим прямые, а не инвертированые повторы последовательностей IS50 (он был сконструирован in vitro и транспозировался с частотами, сравнимыми с частотами Tn5 дикого типа). Это показывает, что для выщепления транспозонов важны инвертированные повторы [ 23 , 74 ]. Влияние длины инвертированных повторов на рекомбинацию между фланкирующими повторами длиной 9 н.п. было изучено на выборке правильных палиндромов, произошедших от 50-kb транспозона, родственного Tn5, описаного выше [ 59 ]. Точное выщепление 22-н.п. палиндрома было в 3-550 раз более эффективно, чем всего 50-н.п. транспозона (были протестированы 13 различных вставок, выщепляющихся с частотой 10-10 - 10-7 ). Для всех, кроме одной, инсерций умеренная дальнейшая стимуляция (максимум в 7.5 раз) наблюдалась, когда длина палиндрома увеличивалась до 32 н.п. Довольно значительная стимуляция (в 9-314 раз) наблюдалась при увеличении длины палиндрома с 32 до 90 н.п. Эффект был даже больше с предыдущей вставкой, так как палиндромы длиной 32 и 90 н.п. подвергались эксцизии в 116 и 18000 раз чаще, чем палиндром длиной в 22 н.п. Использование некоторых дополнительных палиндромов сравнимых размеров (от 18 до 90 н.п.) под- держало и расширило эти наблюдения. Также, укорочение инвертированых повторов с 1500 до 185 н.п. уменьшало эффективность выщепления Tn5 в E.coli примерно в 10 раз [ 220a ]. Все это позволяет предположить, что инвертированые повторы стимулируют рекомбинацию между 9-н.п. прямыми повторами, и что стимуляция усиливается с увеличением длины инвертированых повторов.

Выщепление транспозонов Tn10 и Tn5 проходит подобным образом. Tn10 имеет длину 9.3 kb, содержит 1.4 kb инвертированые повторы IS10 и кодирует устойчивость к тетрациклину [ 147 ]. Он дуплицирует 9-н.п. последовательности-мишени во время инсерции [ 145 ] и может быть изъят путем рекомбинации между дуплицироваными последо- вательностями. Кроме этого процесса, названного "точное выщепление", Tn10 может подвергаться "почти точному" выщеплению. Это соответствует рекомбинации между 23/24-н.п. прямыми повторами, присутствующими в двух элементах IS10. Почти точное выщепление оставляет 50 нуклеотидных пар транспозона, фланкированных 9-н.п. прямыми повторами. Этот остаток состоит из двух 23-н.п. инвертированых повторов, разделенных четырьмя н.п. Он также может быть удален рекомбинацией между фланкирующими 9-н.п. прямыми повторами.

Три типа событий выщепления, связаных с Tn10 (точное выщеплеие, почти точное выщепление и выщепление остатка) не требуют транспозазы [ 79 ]. Инвертированные повторы, по-видимому, облегчают точное и почти точное выщепление, так как частота двух событий была в 10 и 100 раз ниже у Tn10-производных, имеющих инвертированые повторы длиной 400 или 70 н.п., чем у транспозонов дикого типа. Средняя частота выщепления транспозона была 10-6 и 10 -8 для точного и почти точного выщепления, соответственно. Различий от сайта к сайту для точного выщепления транспозона или 50-н.п. остатка наблюдалось больше (в 30 и 100 раз, соответственно), чем для почти точного выщепления (около 7 раз). Так как рекомбинирущие прямые повторы варьировали от сайта к сайту для точного, но не для почти точного выщепления, можно предположить, что природа рекомбинирующих последовательностей влияет на частоту рекомбиации.

Бактериофаг Mu не содержит длинных концевых инвертированных повторов и делает только 5-н.п. прямые повторы. Его выщепление, наблюдавшееся только у плейотропных мутантов, которые утеряли функции фага B и не убивали своего хозяина, отличается в двух пунктах от выщепления транспозонов Tn5 и Tn10: (i) выщепление требует транспозазу фага [ 32 , 143 ], и (ii) точное выщепление, использующее 5-н.п. повторы, сгенерированые инсерцией фага, в 10- 100 раз менее часты, чем неточное выщепление, использующее последовательности ДНК фага или хозяина, или и то и другое [ 32 , 143 , 204 ]. Выщепление часто использует короткие гомологичные последовательности (в 11 из 17 проанализированых случаев) и это приписывается репликационным ошибкам транспозазы, прикрепленной к концам фага [ 204 ].

Ссылки: