ДНК: H-форма
H-форма ДНК - неканоническая структура в гомопурин- гомопиримидиновых участках ДНК. В начале 80-х годов было обнаружено, что гомопурин-гомопиримидиновые последовательности в отрицательно сверхспирализованной ДНК обладают гипер- чувствительностью к эндонуклеазе S1, специфически расщепляющей одноцепочечную ДНК ( Hentschel C.C., 1982 , Htun H. ea, 1984 , Larsen A. and Weintraub H., 1982 ). Однако эти данные как и данные по химической модификации не позволили в то время сделать каких-либо определенных выводов об этой структуре, отчасти в силу расхождений результатов разных авторов. Значительное продвижение в изучении вопроса было достигнуто в работах Франк-Каменецкого с сотрудниками, которые использовали метод двумерного электрофореза для исследования структурных изменений в этих участках ( Лямичев В.И. и др., 1986 , Mirkin S.M. ea, 1987a ).
В работе Лямичев В.И. и др., 1986 было показано, прежде всего, что в гомопурин-гомопиримидиновых участках действительно происходит образование неканонической структуры - на электрофореграммах кольцевых ДНК с соответствующими вставками наблюдался скачок подвижности, обусловленный конформационными изменениями в этих участках. Образование этой структуры в топологическом отношении было эквивалентно расплетанию двойной спирали или переходу участка в крестообразную форму - параметр k равнялся 1 ( Термодинамический анализ образования неканонических структур ). Было установлено, что плотность сверхвитков , при которой происходит переход в эту структуру,str , в сильной степени зависит от pH раствора. Зависимость точки перехода от pH во вставке d(AG)16-d(CT)16, полученная в этой работе, представлена на Рис. Зависимость перехода в H-форму от pH . Из этого рисунка ясно, что образование структуры стимулируется увеличением концентрации ионов Н+ в растворе. При pH 4,3 переход происходит при нулевой плотности сверхвитков. Такое влияние ионов Н+ на переход означает, что образующаяся структура является протонированной. Эта особенность новой структуры и побудила авторов назвать ее H-формой .
В той же работе был проведен теоретический анализ образования неканонической структуры под влиянием сверхспирализации с учетом протонирования этой структуры. Такой анализ привел к следующему соотношению для зависимости str; от pH раствора
str = (pH0 - pH)/(10kr) [1], где через r обозначено число пар оснований, отвечающее одному потенциальному месту протонирования в образуемой структуре,pH0 - константа. Сопоставление соотношения [1] с экспериментальными данными на Рис. Зависимость перехода в H-форму от pH показывает, что параметр r в данном случае равен 4, т.е. одно место протонирования приходится на 4 пары оснований. Этот вывод, а также найденное значение параметра k и послужили основой для построения модели H-формы ( Лямичев В.И. и др., 1986 ). В этой модели, изображенной на Рис. H-форма ДНК , гомопиримидиновая шпилька взаимодействует с гомопуриновой цепью, образуя трехнитевой комплекс . Существование такой тройной спирали из двух антипараллельных цепей поли[d(CT)] и одной цепи поли[d(GA)] при слабо кислых pH было показано ранее ( Lee J.S. ea, 1979 ). В этой структуре протонированной является лишь хугстиновская пара GC, и общее протонирование отвечает r = 4. Такая структура может быть образована из раскрытого участка ДНК без проворачивания его концов друг относительно друга, т.е. параметр k равен 1 независимо от периода тройной спирали.
Подтверждение этой модели было получено в работе ( Mirkin S.M. ea, 1987a ). Из модели следует, что H-форма ДНК может образовываться любой гомопурин - гомопиримидиновой последовательностью, являющейся зеркальным повтором (H- палиндромом ). В самом деле, в шпильке, образуемой пиримидиновой нитью, напротив цитозина всегда стоит цитозин, а напротив тимина- тимин. Для проверки этого следствия модели были синтезированы и встроены в плазмиды четыре гомопурин-гомопиримидиновые вставки с последовательностями
d(A2G3AGA2XG4TATAG4YA2GAG3A2). В тех случаях, когда X = Y = A и X = Y = G вставки являются совершенными зеркальными повторами и должны сравнительно легко переходить в H-форму. Для случаев X = A, Y = G и X = G, Y = A симметрия нарушается, и переход в H-форму должен быть или сильно затруднен или вообще заблокирован. Именно такая картина наблюдалась на опыте ( Рис. Двумерный электрофорез H-формы ДНК ). Как видно из рисунка, в случаях X = Y = A и X = Y = G переход в H-форму наблюдается при близкой плотности сверхвитков. Для случая X = A, Y = G переход оказывается сильно сдвинутым в область более высокой плотности сверхвитков, а для X = G, Y = A не наблюдается вовсе. Такая асимметрия в отношении перехода последних двух плазмид не должна вызывать удивления- последовательности вставок с X = A, Y = G и X = G, Y = A вовсе не эквивалентны, поскольку нить ДНК не симметрична относительно замены направления. В этом отношении зеркальная симметрия последовательности H-палиндрома является лишь псевдосимметрией в отличие от истинной симметрии палиндромной области двунитевой ДНК.
В целом ряде работ были получены убедительные доказательства правильности представленной на Рис. H-форма ДНК модели с помощью зондирования различными химическими агентами ( Voloshin O.N. ea, 1988 , Johnston B.H., 1988 , Htun H. and Dahlberg J.E., 1988 ). Так, в работе Voloshin O.N. ea, 1988 образующаяся в гомопурин-гомопиримидиновой области структура зондировалась с помощью диэтилпирокарбоната, избирательно модифицирующего неспаренные аденины. Места модификации были локализованы на уровне отдельных нуклеотидов с помощью электрофореза в геле. Оказалось, что лишь аденины, находящиеся в одной из половин гомопуриновой цепи, способны реагировать с диэтилпирокарбонатом. Этот результат полностью согласуется с предложенной моделью, если из двух возможных изомерных структур, представленных на Рис. H-форма ДНК , образуется лишь одна. Равновесие между двумя изомерными формами Н-ДНК зависит от многих обстоятельств. Зарегистрировать экспериментально широкий переход между этими формами, происходящий при увеличении отрицательной сверхспирализации, удалось, по-видимому, в работе Htun H. and Dahlberg J.E., 1989 .
Долгое время не удавалось получить четких результатов с помощью анализа локализации S1-чувствительных участков. Хотя именно нуклеазное зондирование позволило обнаружить необычную структуру гомопурин-гомопиримидиновых участков, потребовалось важное усовершенствование методики экспериментов, чтобы их результаты допускали однозначную интерпретацию ( Belotserkovskii B.P. ea, 1990 ). Для зондирования структуры Н-ДНК очень эффективным оказался метод фотофутпринтинга ( Lyamichev V.I. ea, 1991 ).
В работе Lyamichev V.I. ea, 1989 определены энергетические параметры образования Н-формы для последовательностей d(CT)n- d(AG)n и d(C)n-d(G)n. Свободная энергия стыка В- и Н-форм оказалась близкой к соответствующей величине для крестообразных структур и составила 18 ккал/моль. Свободные энергии В-Н перехода в расчете на пару оснований для обеих последовательностей линейно зависят от pH раствора. Однако, оценка свободной энергии перехода вставок с последовательностями d(A)n-d(T)n, сделанная на основании полученных данных ( Lyamichev V.I. ea, 1989 ), не согласуется с экспериментальными данными. Эту последовательность значительно труднее перевести в Н-форму, чем следует из такой оценки. Лишь недавно это удалось сделать ( Fox K.R., 1990 ) для протяженной вставки d(A)69- d(T)69 в присутствии ионов магния. Этот результат показывает, что в случае В-Н перехода изменение свободной энергии пары оснований существенно зависит не только от типа данной пары, но и от типа соседних пар.
