ДНК: Химическая модификация
Химическая модификация ДНК - метод локализации структурных переходов , основанный на химической модификации ДНК в местах образования неканонических структур , внесении разрывов по местам модификации и последующем определении местоположения этих разрывов. Этот метод основан на использовании химических реагентов, которые модифицируют основания ДНК по тем местам, которые в регулярной В-форме экранированы структурой двойной спирали. Дальнейшая химическая обработка такой избирательно модифицированной ДНК приводит к расщеплению сахаро-фосфатных цепей в местах первичной модификации. В качестве первичных модифицирующих агентов используются такие соединения, как диэтилпирокарбонат ( Johnston B.H. and Rich A., 1985 , Herr W., 1985 , Furlong J.C. and Lilley D.M.J., 1986 , Scholten P.M. and Nordheim A., 1986 ), модифицирующий неспаренные пурины, диметилсульфат ( Evans T. and Efstratiadis A., 1986 ), взаимодействующий с гуанинами, у которых незащищена позиция N7, четырехокись осмия ( Johnston B.H. and Rich A., 1985 , Lilley D.M.J. and Palecek E., 1984 и Galazka G. ea, 1986 ), модифицирующая неспаренные тимины, и некоторые другие ( Lilley D.M.J., 1983 и Gough G.W. ea, 1986 ).
В случае крестообразных структур модификация прежде всего происходит в петлях шпилек крестов . Для участков ДНК, находящихся в левоспиральной Z-форме , картина модификации зависит от типа химического агента и от последовательности оснований в этом участке. Так, для участка с регулярной последовательностью d(GC)n, перешедшего в Z-форму, диэтилпирокарбонат взаимодействует со всеми гуанинами этого участка, а гидроксиламин лишь с цитозинами, расположенным на стыках B- и Z-форм. Более сложная картина наблюдается для нерегулярных последовательностей, находящихся в Z-форме ( Herr W., 1985 ). Очень эффективным оказался метод химической модификации и для установления структуры H-формы ДНК ( Voloshin O.N. ea, 1988 , Htun H. and Dahlberg J.E., 1988 , Johnston B.H., 1988 ).
В тех случаях, когда область (или области) образования специфических разрывов неизвестны, для предварительного грубого картирования используется рестрикционный анализ. Молекулы ДНК, переведенные в линейную форму с помощью химического разрезания, обрабатываются какой-нибудь рестриктазой для получения набора рестрикционных фрагментов. Этот набор фрагментов сопоставляется путем электрофоретического разделения по длинам с реперным набором, полученным с помощью обработки той же рестриктазой немодифицированной кольцевой ДНК. Если разрезание по месту структурного нарушения происходило в одной области ДНК, на электрофореграмме первого набора фрагментов должны появиться две дополнительные по сравнению с контрольным набором полосы. Кроме того, одна из полос контрольного набора должна отсутствовать в первом наборе фрагментов (или стать значительно менее интенсивной, если эффективность линеаризации была неполной). Определив длины дополнительных фрагментов по градуировке геля и зная локализацию в последовательности разрезанного фрагмента, можно найти два возможных места структурного нарушения. Для однозначной локализации необходимо повторить тот же опыт с другой рестриктазой. Схематическое изображение результатов такого эксперимента, взятое из работы ( Lilley D.M.J., 1980 ), приведено на Рис. Результаты эксперимента из работы Lilley D.M.J., 1980 .
После предварительной локализации места специфического разрезания ДНК можно получить распределение разрывов на нуклеотидном уровне. Для этого используется методика, применяемая при расшифровке нуклеотидных последовательностей. Различие состоит лишь в том, что в случае расшифровки последовательностей необходимо внести разрывы в изучаемый рестрикционный фрагмент ДНК по определенному типу оснований, а при картировании мест химической модификации эти разрывы вносятся по модифицированным местам структурного нарушения. Электрофоретическое разделение меченых одноцепочечных фрагментов позволяет определить их длины с точностью до одного нуклеотида и тем самым прокартировать места разрывов или химической модификации относительно точки рестриктазного расщепления.
Для локализации Н-формы ДНК был использован метод фотомодификации ( photofootprinting ) ДНК ( Lyamichev V.I. ea, 1991 ). Этот метод основан на изменении доли фотопродуктов составляют пиримидиновые димеры, образуемые соседними по цепи ДНК пиримидинами, и, следовательно, для этой ДНК метод оказывается очень эффективным. Локализация образования фотопродуктов основана на тех же принципах внесения разрывов в места фотоповреждений и последующей локализации этих разрывов. Установлено то, что для крестообразных структур параметр k ра на самом деле, при их образовании происходит полное раскручивание соответствующего участка B-ДНК, а в крестообразной структуре гамма нити не закручены друг относительно друга
