ДНК: B-Z переход
Z-форма была открыта для гексануклеотида d(CGCGCG) ( Wang A.H.-J. ea, 1979 ), и именно полинуклеотид poly(dG-dC) легче всего переходит в лево-спиральную Z-форму. Большая часть работ, касающихся исследований B-Z перехода в линейных ДНК, выполнена с этим полинуклеотидом или его метилированными аналогами (см. Rich A. ea, 1984 и цитированные там работы). Переход poly(dG-dC) из B- в Z-форму наблюдается при высокой концентрации ионов натрия (2,4 М) или при добавлении некоторых двухвалентных ионов.
Процесс превращения правой спирали B-ДНК в левую спираль Z-ДНК протекает, по-видимому, с сохранением общей спиральной структуры и не связан с расхождением цепей. Переход индуцируется разрывом нескольких пар оснований, после чего гуанин "закрепляется" в син-конформации, а дезоксицитидин поворачивается как целое (при таком повороте анти-конформация сохраняется). Затем водородные связи восстанавливаются, и основания вновь образуют уотсон-криковские пары ( Wang A.H.-J. ea, 1979 ). Это означает, что полного расхождения цепей не требуется, и область В-Z перехода перемещается вдоль спирали в виде небольшой петли.
Если в спирали В-ДНК осуществляется переход в Z-форму, можно ожидать, что этот процесс будет зависеть от нуклеотидной последовательности. Так как расстояние между фосфатами нуклеотидной пары в В-ДНК, равное 17,5 А, ближе к значению 15 А, характерному для участков Z-ДНК d(GpC), чем к 12,5 А для d(СpG), то В-Z переход, вероятно, в первую очередь будет происходить на участках d(GpC). В любом случае в месте стыка В- и Z-форм стэкинг оснований нарушится и на границе раздела будет присутствовать по крайней мере одна пара оснований с разорванными водородными связями. Эта модель экспериментально подтверждается: процесс превращения правой спирали в левую характеризуется большой величиной энергии активации, 21 ккал/моль ( Pohl F.M. and Jovin T.M., 1972 ).
Термодинамические исследования показали, что переход В-Z кооперативен ( Pohl F.M. and Jovin T.M., 1972 ). Это означает, что, если в двойной спирали В-ДНК образуется зародыш Z-формы, он индуцирует В-Z переход в соседних парах и, таким образом, разрастается по полинуклеотидной цепи. В-Z переход, как и переход В-А , практически не зависит от температуры (дельта Н около 0 ккал/моль), и этим отличается от В-С перехода (дельта Н равна -10 ккал/моль), у которого равновесие сдвигается в сторону образования C-формы при понижении температуры. Повышение температуры слегка сдвигает B-Z равновесие в сторону стабилизации Z-формы ДНК. Об этом свидетельствуют опыты с линейными полинуклеотидами ( Roy K.B. and Miles H.T., 1983 ) и со вставками, встроенными в кольцевые ДНК ( O'Connor T.R. ea, 1986 ).
Образование Z-ДНК может стимулироваться не только добавлением в раствор соли, но и отрицательной сверхспирализацией в кольцевой замкнутой ДНК. Действительно, переход участка ДНК из правой B-спирали в левую Z-спираль должен вызывать наибольший по сравнению с другими неканоническими структурами сброс напряжения сверхспирализации . Было показано, что под действием отрицательной сверхспирализации участки с последовательностями d(CG)n могут переходить в Z-форму при обычных ионных условиях ( Singleton C.K. ea, 1982 , Wang J.C. ea, 1983 ). При увеличении концентрации ионов сначала величина str растет, а затем начинает падать ( Singleton C.K. ea, 1982 , Azorin F. ea, 1983 , Pohl F.M., 1983 , Peck L.J. and Wang J.C., 1983 , Stirdivant S.M. ea, 1982 ). Падение str при высокой концентрации ионов Na+ связано с уменьшением свободной энергии перехода в линейной ДНК. Максимальное значение свободной энергии перехода наблюдается для концентрации 0,2 M ( Stirdivant S.M. ea, 1982 ).
Рассмотрим статистико-механическое описание B-Z перехода в линейной ДНК с произвольной последовательностью. С точки зрения статистико-механического описания важнейшая особенность Z-ДНК состоит в том, что повторяющейся единицей спирали является не пара нуклеотидов, а двойка соседних нуклеотидных пар. Поэтому при статистико-механическом описании нужно учитывать тот факт, что каждая пара оснований в Z-форме может находиться в одном из двух энергетически неэквивалентных состояний ( Rich A. ea, 1984 ). Первое (I) из этих состояний характеризуется син-конформацией пурина и анти-конформацией пиримидина. Это состояние энергетически более выгодно, и именно оно реализуется в регулярных пуринпиримидиновых последовательностях. Второе состояние (II) отвечает син- конформации пиримидина и антиконформации пурина. Хотя это состояние характеризуется более высокой свободной энергией, оно может реализоваться в некоторых последовательностях, так как регулярная структура Z-спирали требует строгого чередования син- и анти- конформаций нуклеотидов в каждой цепи (смотри Рис. Чередование конформаций оснований в Z-ДНК ). В то же время в регулярной пуринпиримидиновой последовательности все пары оснований в Z-форме могут находиться в состоянии (I), и именно поэтому такие последовательности с самого начала считались наиболее вероятными для образования Z-ДНК ( Wang A.H.-J. ea, 1979 ). Таким образом, свободная энергия перехода пары в Z-форму D F должна зависеть не только от сорта пары, но и от ее конформации в Z-спирали (I или II). Дополнительная свободная энергия FBZj отвечает границе между двумя структурными формами. В Z-форме может, однако, возникать еще один тип границ, Z-Z границы, которые отвечают сбою регулярного чередования син- и анти-конформаций оснований в цепи ДНК (поскольку последовательность и конформация нуклеотидов в одной цепи полностью определяют последовательность и конформацию в другой цепи, ниже будет рассматриваться одна, произвольно выбранная цепь). Этой границе, которую можно рассматривать как "смену фазы" в Z-форме, отвечает свободная энергия FZZj. Проиллюстрируем вычисление свободной энергии участка, находящегося в Z-форме, на примере Z-спирали, образованной последовательностью GCGGTCC и окруженной участками в В-форме ( Рис. Z-Z граница ). Через Za и Zs здесь обозначены анти- и син-конформации нуклеотида в выбранной цепи ДНК.
Таким образом, эта модель учитывает три возможных состояния каждой пары оснований и содержит шесть энергетических параметров:
D FIGC, D FIAT,
D FIIGC, D FIIAT,
FBZj, FZZj.
. Тот факт, что в обычных условиях в растворе образование Z-ДНК энергетически невыгодно, означает, что все величины D F положительны (при высокой концентрации натрия отрицательной становится лишь D FIGC). Описанная модель B-Z перехода впервые была предложена в работе ( Вологодский А.В., 1985 ).
Параметры этой модели определялись последовательно на основании анализа экспериментальных данных по B-Z переходу во вставках с различными последовательностями ( Mirkin S.M. ea, 1987b , Peck L.J. and Wang J.C., 1983 и Ellison M.J. ea, 1985 ). В таблице 1 приведен полный набор из шести параметров.
| Таблица 1. Значения параметров В-Z перехода | ||
|---|---|---|
| Параметр | Значение kkaл/моль | Ссылка |
| D FIGC | 0.33 | Peck L.J. and Wang J.C., 1983 |
| D FIAT | 1.15 | Mirkin S.M. ea, 1987b |
| D FIIGC | 2.6 | Ellison M.J. ea, 1985 |
| D FIIAT | 3.6 | Ellison M.J. ea, 1985 |
| FBZj | 5.2 | Peck L.J. and Wang J.C., 1983 |
| FZZj | 4.0 | Mirkin S.M. ea, 1987b |
Как и следовало из первых экспериментов по B-Z переходу, наименьшей свободной энергией в Z-форме обладает GC-пара в состоянии I. Энергия АТ-пары в Z-форме в состоянии I оказывается значительно выше. Это объясняет, в частности, тот факт, что последовательности d(AT)n переходят под влиянием отрицательной сверхспирализации в крестообразные структуры , а не в Z-форму. Энергии AT- и GC-пар в состоянии II оказываются примерно на 2 ккал/моль выше соответствующих величин в состоянии I. Это означает, что некоторая доля пар в неподходящей ориентации может присутствовать в областях, имеющих повышенную склонность к B-Z переходу. Энергия смены фазы FZZj оказалась почти такой же, как и энергия B-Z границы, FBZj. Сравнительно большая величина FZZj делает невыгодной частую смену фазы в Z-форме. Приведенные параметры соответствуют вполне определенным ионным условиям (ТВЕ-буфер), использованным впервые в работе ( Peck L.J. and Wang J.C., 1983 ). Все эксперименты, на основании которых составлена таблица 1, выполнены именно в этих условиях.
Проверка того, что величины D F действительно не зависят от ближайших соседей, а определяются типом и конформацией данной пары, была проведена в работе ( Mirkin S.M. ea, 1987b ). Для этого параметр D FIAT был независимо найден из трех типов пурин-пиримидиновых вставок. В первой вставке AT-пары контактировали лишь с GC-парами, а в двух других присутствовали также контакты АТ-пар друг с другом. Значения D FIAT, найденные на основании независимого анализа всех трех экспериментов, совпали и составили 1,15 ккал/моль, свидетельствуя тем самым в пользу проверяемого предположения. Практически то же значение этого параметра (1,2 ккал/моль) было получено в работе Ellison M.J. ea, 1986 , в которой изучался B-Z переход во вставке d[C(GC)6 (AT)4 (GC)6G]. В этой вставке AT-пары контактируют почти исключительно между собой. Таким образом, имеются веские основания полагать, что изложенная выше модель адекватно описывает энергетику B-Z перехода ДНК с произвольной последовательностью оснований.
Изложенная модель позволяет предсказывать, в каких местах интересующей нас ДНК раньше всего должны образовываться участки в левоспиральной Z-форме по мере увеличения отрицательной сверхспирализации. Для этого необходимо выполнить соответствующие статистико-механические расчеты, которые представляют достаточно сложную математическую задачу. В настоящее время разработаны несколько эффективных алгоритмов для проведения таких расчетов ( Anshelevich V.V. ea, 1979 , Anshelevich V.V. ea, 1988 , Вологодский А.В., 1985 ) . Пример такого расчета для ДНК fX174 на Рис. Сравнение теории и эксперимента по B-Z переходу в ДНК fX174 представлен вместе с экспериментальными данными о вероятности образования Z-формы в различных областях ДНК fХ174 (точнее, вероятности связывания анти-Z антител с данным местом ДНК), полученная в ( Revet B. ea, 1984 ). Расчет проводился на основании изложенной модели B-Z перехода и известной нуклеотидной последовательности ДНК fХ174 примерно для той же плотности сверхвитков , которая использовалась в опыте. Сопоставление свидетельствует о хорошем согласии теории с экспериментом.
Кинетика B-Z перехода, происходящего под влиянием отрицательной сверхспирализации , исследована недостаточно; имеются лишь две работы, посвященные экспериментальному изучению этого вопроса ( Peck L.J. ea, 1986 Pohl F.M., 1986 ), где показано, что времена релаксации в случае B-Z перехода составляют минуты и десятки минут и быстро уменьшаются при увеличении отрицательной сверхспирализации ( Рис. Кинетика B-Z перехода в КЗ ДНК ).
