ДНК: крестообразных структур кинетика
Кинетика крестообразных структур - временные зависимости образования и разрушения крестообразных структур в ДНК. Переход участка ДНК из B-формы (B) в крестообразную структуру (С) является процессом первого порядка и описывается схемой
k1
B ======== C,
k2
где через k1 и k2 обозначены константы скорости прямого и обратного процессов. Установление равновесия в такой системе описывается экспоненциальной кинетикой с постоянной времени
-1 t = (k1 + k2) (1)
Таким образом, время релаксации определяется наибольшей в данных условиях константой скорости.
При образовании крестообразной структуры из регулярной двойной спирали процесс должен идти в два этапа. Сначала появляется зародыш новой конформации, а затем он может разрастись до равновесных размеров структуры в данных условиях. В случае крестообразной структуры, радикально отличающейся от B-формы, образование зародыша не может происходить иначе, как через раскрытие соответствующего ему участка. Этот раскрытый участок должен соответствовать минимальной длине, на которой можно образовать устойчивые по сравнению с раскрытым состоянием участка шпильки креста , т.е. включать 12 - 15 пар оснований. Флуктуационное раскрытие участка такой длины при комнатной температуре в релаксированной ДНК является крайне редким событием, но по мере увеличения отрицательной сверхспирализации вероятность этого раскрытия резко увеличивается. Как показывают оценки( Vologodskii A.V. and Frank-Kamenetskii M.D., 1983 ), именно образование зародыша крестообразной структуры является лимитирующей стадией процесса. Из этого можно сделать вывод, что константа скорости образования крестообразных структур k1 не должна зависеть от их размеров, но будет очень резко зависеть от плотности сверхвитков . Этот вывод подтверждают данные работы ( Gellert M. ea, 1983 ), в которой изучалась кинетика образования крестов в палиндромах разной длины при различной плотности сверхвитков.
Рассмотрим обратный процесс перехода палиндромной области из крестообразной структуры в регулярную двойную спираль. Этот процесс идет по следующей схеме. Равновесный размер крестообразной структуры флуктуационно уменьшается до размеров зародыша, который переходит в раскрытую область, быстро схлопывающуюся в B-спираль. Уменьшение размеров крестообразной структуры будет происходить за счет переброса двух симметричных пар, прилегающих к основанию креста, в основную спираль. Этот процесс носит характер случайного блуждания, т.е. может идти и в обратную сторону. Подобный процесс случайного блуждания точки скрещивания четырех попарно комплементарных цепей был количественно исследован в работе ( Thompson B.J. ea, 1976 ) ( Рис. Смещение точки скрещивания в крестообразной структуре ). В этой работе показано, что константа скорости элементарного шага k+ в таком процессе составляет около 1000 1/с. Однако случайное блуждание точки скрещивания в случае крестов в кольцевых ДНК отличается от исследованного в ( Thompson B.J. ea, 1976 ). В этом случае вероятность смещения точки скрещивания в сторону уменьшения размеров креста (p+) значительно меньше вероятности обратного шага (p-). Это связано с тем, что уменьшение размеров креста соответствует увеличению энергии сверхспирализации , а обратный шаг отвечает уменьшению этой энергии (при n меньше или равно m0), (смотри Термодинамический анализ образования неканонических структур ). Изменение свободной энергии сверх- спирализации в результате одного элементарного смещения точки скрещивания, D G, удовлетворяет соотношению
D G= 40*R*T*s (2)
и, следовательно,
p-/p+ = exp(40*s ) (3)
Как следует из (3), при s = -0,05 отношение p-/p+ оказывается близко к 0,1. Это означает, что уменьшение размеров крестообразной струтуры на несколько пар оснований потребует в среднем огромного числа шагов, и, следовательно, огромного времени. Количественный анализ этого процесса позволил определить константу развала креста k-, а следовательно, и k+ ( Vologodskii A.V. and Frank-Kamenetskii M.D., 1983 ).
Результаты расчетов, выполненных для палиндромов различной длины приведены на Рис. Время релаксации крестообразных структур . Максимальное время релаксации для каждого палиндрома отвечает точке равновесного перехода между крестообразной и линейной формами. В этой точке время релаксации оказывается огромным практически для всех крестообразных структур, которые возникают под влиянием отрицательной сверхспирализации. Это время резко увеличивается по мере того, как точка равновесного перехода смещается в область меньшей плотности сверхвитков, т.е. по мере увеличения размеров палиндрома. Однако в области устойчивости крестообразных структур время релаксации (в данном случае время образования креста) зависит лишь от плотности сверхвитков. Эти результаты показывают, что при комнатной температуре, для которой проводился расчет, образование крестообразной структуры может наблюдаться только при достаточно высокой плотности сверхвитков, превышающей по абсолютной величине 0,05. При меньших значениях s за характерные времена опыта переход просто не успевает произойти.
Теоретическая зависимость времени релаксации крестообразных структур, образующихся в кольцевых ДНК, представленная на Рис. Время релаксации крестообразных структур хорошо согласуется с экспериментальными данными работ ( Panyutin I. ea, 1984 , Courey A.J. and Wang J.C., 1988 ). Эти работы посвящены изучению кинетики образования крестов в зависимости от плотности сверх- витков.
Время релаксации очень резко зависит от температуры раствора ( Naylor L.H. ea, 1986 , Iacono-Connors L. ea, 1986 , Gellert M. ea, 1983 , Sinden R.R. and Pettijohn D.E., 1984 ). Так, при температуре в несколько градусов Цельсия время образования крестообразной структуры даже при s =-0,06 может составлять недели и более. Как показано в работе ( Panyutin I. ea, 1985 ), времена релаксации в последовательности d(AT)n оказываются значительно меньше времен релаксации палиндромов соответствующей длины с GC-содержанием, близким к 0,5. Этот факт объясняется тем, что флуктуационное раскрытие областей, состоящих только из AT- пар, происходит несравненно чаще. Вопрос о влиянии GC-состава центра палиндрома на кинетику образования крестов специально исследовался в работе ( Courey A.J. and Wang J.C., 1988 ).
В работе Sinden R.R. and Pettijohn D.E., 1984 было показано, что скорость элементарного акта в процессе уменьшения размеров креста замедляется на несколько порядков в присутствии ионов Mg2+. Природа этого эффекта не вполне понятна. По-видимому, ионы Mg2+ образуют очень стабильные комплексы в области скрещивания четырех спиралей. В некоторых случаях кинетика образования крестообразных структур зависит не только от характеристик палиндромной области, но и от ее окружения ( Sullivan K.M. and Lilley D.M.J., 1986 ).
