Тройные спирали: применение для модулирования работы генов
Встречаемость гомопуриновых участков определенной длины в геноме какого-либо организма можно оценить, исходя из предположения о случайном распределении нуклеотидов в геномной ДНК. Компьютерный анализ опубликованных последовательностей ДНК различных организмов ( Behe M.J., 1995 ) показывает, что для прокариотических геномов имеет место хорошее соответствие между наблюдаемыми и расчетными частототами встречаемости гомопуриновых блоков длиной более 15 н. (1 блок на 5000 - 50000 п.н.). В то же время для большинства эукариотических геномов, начиная с генома дрожжей и кончая геномом человека, реальная частота встречаемости гомопуриновых блоков с длиной более 15 н. в 4-6 раз больше расчетной и составляет для млекопитающих в среднем 1 блок на 1400 п.н. Поскольку с учетом интронов размеры эукариотических генов обычно на порядок больше 1400 п.н., это означает, что шансы найти в произвольном гене эукариотического организма последовательность-мишень для тройной спирали близки к 100%.
Столь высокая встречаемость гомопуриновых блоков в геномах эукариот открывает перспективу для попыток модулирования работы генов путем направленного формирования тройных спиралей на участках-мишенях геномной ДНК. Уникальным принципиальным преимуществом данного подхода является отсутствие необходимости внесения в клетку большого количества эффекторных молекул. Так как модуляция должна осуществляться на уровне геномной ДНК, для получения эффекта теоретически достаточно двух молекул третьей цепи на клетку с диплоидным набором хромосом.
Присутствие третьей цепи может нарушать работу клеточного аппарата транскрипции несколькими разными способами. Располагаясь в области регуляторных элементов, контролирующих инициацию транскрипции, тройная спираль в некоторых случаях препятствует связыванию с этими элементами соответствующих белков-активаторов. Так, в работе Grigoriev M. ea, 1992 показано образование тройного комплекса на гомопуриновом участке длиной 15 п.н. в регуляторной области гена ## альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 . Использованный авторами гомопиримидиновый олигонуклеотид , содержащий метилированные цитозины и коньюгированный с акридином, после формирования комплекса специфически защищал последовательность-мишень от связывания с транскрипционным фактором NFkВ . При введении в клетки модельного гена, несущего тройной комплекс в промоторной области, активация транскрипции оказывалась подавленной в несколько раз.
Аналогичный эффект был продемонстрирован Мейфилдом и соавторами на примере промоторной области клеточного протоонкогена Ha-ras человека ( Mayfield C. ea, 1994a ). Добавление к изолированному промотору Ha-ras олигонуклеотида, способного к образованию антипараллельной тройной спирали , не давало возможности транскрипционному фактору Sp1 связаться со своим сайтом узнавания и ингибировало транскрипцию в клеточном экстракте. Эти же авторы, занимаясь исследованием гомопуринового блока в промоторе гена Ki-ras человека, показали, что олигонуклеотиды с последовательностями типа ## AG и GТ, образуя на этом блоке антипараллельную тройную спираль, мешают связыванию некоего ядерного белка, выявляемого по замедлению подвижности ДНК в геле ( Mayfield C. ea, 1994b ). Сходные результаты были получены другими исследователями в экспериментах in vitro с промоторами генов дигидрофолат редуктазы ( Gee J.F. ea, 1992b ), аминотрансферазы ( Ing N.H. ea, 1993 ), протоонкогена HER-2/neu ( Ebbinghaus S.W. ea, 1993 ).
Присутствие третьей цепи в промоторной области гена может сказываться также на формировании базального транскрипционного комплекса, в частности, на связывании РНК-полимеразы. Установлено, что тройная спираль препятствует инициации транскрипции in vitro в прокариотических системах с участием РНК- полимеразы фага Т7 ( Maher III L.J., 1992 , Ross C. ea, 1992 ).
Махер III и соавторы наблюдали ингибирование базальной активности синтетического эукариотического промотора в клеточном экстракте после формирования тройной спирали вблизи точки начала транскрипции ( Maher III L.J. ea, 1992 ). Авторами был предложен еще один, конформационный, механизм вмешательства тройной спирали в сборку транскрипционного комплекса: гипотетический изгиб ДНК вследствие связывания третьей цепи приводит к изменению расстояний между различными белковыми компонентми комплекса и нарушению их взаимодействия. Косвенным подтверждением правомерности данной гипотезы может служить работа Вестин и соавторов, в которой получены доказательства конформационных изменений ДНК-гистонового нуклеосомного агрегата при формировании тройной спирали ( Westin L. ea, 1995 ).
Если же мишень для тройной спирали располагается ниже по течению от точки начала транскрипции, то присутствие третьей цепи может влиять на элонгацию, замедляя или совсем останавливая движение транскрипционной машины. Этот эффект был продемонстрирован как в прокариотических системах с РНК- полимеразами E.coli, T3 и Т7 ( Duval-Valentin G. ea, 1992 , Rando R.F. ea, 1994 ), так и в системе эукариотической транскрипции в экстракте клеток Jurkat ( Young S.L. ea, 1991 ). Для усиления эффекта в такой ситуации многие исследователи применяют модификацию олигонуклеотидов 4,5',8-триметилпсоралем по 5'- концу. Ультрафиолетовое облучение тройных спиралей после их образования вызывает ковалентные сшивки между модифицированным олигонуклеотидом и ДНК-мишенью и необратимо блокирует транскрипцию ( Duval-Valentin G. ea, 1992 , Macaulay V.M. ea, 1995 ).
