Необычный состав центромерного хроматина
Данные об эпигенетическом регулировании центромерной идентичности и воспроизведении указывают на вероятность того, что ключевыми детерминантами являются структура и состав хроматина, а не первичные последовательности ДНК. Здесь мы обсудим различные компоненты и структуры, обнаруживаемые в хроматине CEN , а также удивительное наблюдение, показывающее, что эти свойства консервативны у далеко отстоящих друг от друга эукариот.
У всех эукариот в центромерных нуклеосомах присутствуют специфичные для центромер белки семейства CENP-A , подобные гистону НЗ ( рис. 14.6 а). Они служат и структурной, и функциональной основой для кинетохора и являются превосходными кандидатами на роль эпигенетической метки, устанавливающей и воспроизводящей центромерную идентичность ( Cleveland et al., 2003 ). В отличие от большинства белков кинетохоров, собирающихся во время митоза, CENP-A присутствует в центромерах на протяжении всего клеточного цикла, что является одним из первых указаний на его важность для центромерной идентичности. У дрожжей, червей, мух и млекопитающих хроматин, содержащий CENP-A, обеспечивает также основу, существенную для рекрутирования белков кинетохора, прикрепления веретена и нормального расхождения хромосом ( Carroll and Straight, 2006 ). Эксперименты по реципрокному эпистазу показали, что CENP-A является первым белком на пути сборки кинетохора, что согласуется с его физической локализацией в хроматине в основании кинетохора в митотических хромосомах. Дальнейшие доказательства важности CENP-A для формирования кинетохора вытекают из опытов по сверхэкспрессии у мух, в которых неправильная локализация CENP-A в нецентромерных районах производит функциональные эктопические кинетохоры ( Heun et al., 2006 ). Поэтому, коль скоро этот вариант гистона существен для центромерной функции, мы в настоящее время определяем CEN-хроматин как район ДНК и белков, связанных с CENP-A.
Структура нуклеосом, содержащих CENP-A, необычна по сравнению с каноническими гистоновыми корами, содержащими НЗ, Н2A, Н2В и Н4. Нуклеосомы CENP-A можно собрать in vitro из очищенного CENР-A и гистонов Н2A, Н2В и Н4, что согласуется с предыдущими наблюдениями, показывающими, что in vivo они гомотипичны (т.е.содержат две копии CENP-A, а не одну копию НЗ и одну копию CENP-A) ( Yoda et al., 2000 ). Детальный биофизический анализ показал, что интерфейс между CENP-A и Н4 отличается от интерфейса НЗ-Н4, и домен, взаимодействующий с Н4 достаточен для "нацеливания" CENP-A на центромеры в присутствии эндогенного CENP-A ( Black et al., 2004 ).
Замещение гистона НЗ белком CENP-A в центромерных нуклеосомах первоначально позволяло думать, что CENP-A составляет весь хроматин, связанный с кинетохором. У S. pombe CENP-A равномерно распределен по центральным коровым участкам величиной 5-7 т.п.н. Эти коры фланкируются крупными гетерохроматиновыми доменами, содержащими метилирование НЗК9 и белки гетерохроматина ( Pidoux and Allshire, 2004 ). Однако детальный цитологический анализ и исследования с использованием иммунопреципитации обнаружили, что у многоклеточных эукариот центромерный хроматин имеет более сложный состав и организацию. Центромеры Drosophila, человека и риса содержат перемежающиеся блоки нуклеосом, содержащих НЗ и CENP-A (в совокупности называемые CEN-хроматином), фланкированные еще более крупными блоками (от тысяч до миллионов пар нуклеотидов) перицентромерного гетерохроматина ( рис. 14.6 б) ( Blower et al., 2002 ; Yan et al., 2005 ).
Чередование [interspersion] доменов НЗ и CENP-A ставит ключевые вопросы относительно эпигенетической природы CEN-хроматина . В частности, модифицированы ли субдомены НЗ в CEN-хроматине многоклеточных эукариот подобно гетерохроматину или эухроматину? Или же они маркированы уникальным образом? Далее, эквивалентна ли каждая перемежающаяся единица CENP-A/H3 в более крупных эукариотических центромерах единичной центромере S. pombe? К этим вопросам обратились, изучая посттрансляционные модификации, характеризующие перемежающиеся блоки нуклеосом НЗ и CENP-A и обнаружившие еще большую сложность. Удивительно, что у человека и мух перемежающиеся домены НЗ содержат НЗК9mе2-метку, обычно ассоциированную с эухроматином - и, более того, не имеют НЗК9mе2 и НЗК9mеЗ, ассоциированных с фланкирующим гетерохроматином ( рис. 14.7 а) ( Sullivan and Karpen, 2004 ; Lam et al., 2006 ). Однако, как и в гетерохроматине, в перемежающихся нуклеосомах НЗ отсутствовали множественные формы ацетилирования НЗ и Н4, как отсутствовал и НЗК4me3. Таким образом, нуклеосомы НЗ в CEN-хроматине обнаруживают паттерн модификаций, отличающийся от канонических эухроматина или гетерохроматина ( рис. 14.7 б). Эти результаты наводят также на мысль, что центросомы мух и человека не составлены просто из повторяющихся S. pombe-подобных центромер. Важно, однако, отметить, что общая организация центромерных районов консервативна, так что у всех многоклеточных эукариот и у S. pombe весь хроматиновый домен CENP-A фланкируется перицентромерным гетерохроматином, содержащим метилирование НЗК9.
Какова возможная функциональная роль модификаций гистонов в CEN и фланкирующем хроматине? Отдельные состояния хроматина в районе CEN, вероятно, вносят вклад в разнообразные свойства центромерных доменов, такие как установление сроков для дифференциальной репликации CEN и фланкирующего гетерохроматина ( Sullivan and Karpen, 2001 ; Blower et al., 2002 ). Модификации фланкирующего перицентромерного гетерохроматина могут также поддерживать размеры центромер, создавая барьер против расширения CEN-хроматина. У Drosophila CEN-хроматин легко распространяется на соседние последовательности, когда фланкирующий гетерохроматин удаляется, делая возможной активацию неоцентромеры ( рис. 14.5 б) ( Maggert and Karpen, 2001 ), а сверхэкспрессия CENP-A приводит к неправильной локализации в эухроматин, но не гетерохроматин ( Heun et al., 2006 ). Интересно, что результатом сверхэкспрессии CENP-A в клетках человека является распространение CEN-хроматина и изменения в метилировании НЗК9 во фланкирующих участках ( Lam et al., 2006 ). Таким образом, размеры центромер, по-видимому, определяются балансом между двумя эпигенетическими состояниями: CEN-хроматином и фланкирующим перицентромерным гетерохроматином.
Концентрация белков, необходимых для сцепления (когезии) сестринских хроматид, которое устанавливается одновременно с репликацией ДНК в фазе S, выше всего в гетерохроматине, фланкирующем центромеру. Это распределение, по-видимому, вносит вклад в соответствующую двойную ориентацию кинетохоров в митозе, а также в поддержание сцепления во время метафазы несмотря на развиваемые веретеном силы, концентрирующиеся в кинетохорах/центромерах ( Watanabe, 2005 ). Эпигенетическое регулирование сцепления включает рекрутирование когезинов белками НР1 ( Swi6 у S. pombe ), которое, в свою очередь, опосредуется высокими концентрациями метилирования НЗК9 в перицентромерном гетерохроматине ( Nonaka et al., 2002 ). Таким образом, специфичные для CEN комбинации модификаций гистонов тоже могли бы быть важными для рекрутирования когезионных комплексов к гетерохроматину вблизи сестринских кинетохоров, обеспечивая в то же время пространственное разделение когезионных и кинетохорных доменов ( Sullivan and Karpen, 2004 ; см. также главу " ЭПИГЕНЕТИКА SCHIZOSACCHAROMYCES РОМВЕ И NEUROSPORA CRASSA ").
В митотических хромосомах человека и Drosophila субдомены CENP-A сливаются, образуя трехмерную цилиндрическую структуру, в значительной мере исключающую нуклеосомы НЗ ( Blower et al., 2002 ). Блоки нуклеосом CENP-A ориентированы на поверхности хромосом, направленной к полюсам, а блоки нуклеосом НЗ локализованы по направлению к внутреннему району хроматид. Внутренние и внешние белки кинетохора обернуты вокруг цилиндра CENP-A; это трехмерное расположение согласуется с CENP-A, играющим центральную роль в рекрутировании других кинетохорных белков ( Blower et al., 2002 ). Для того чтобы согласовать двумерное чередование блоков CENP-A и НЗ ( рис. 14.6 б и 14.7 б) с разделением в трехмерных митотических хромосомах, предположили, что CEN-ДНК может закручиваться спиралью или выпетливаться в цилиндрической структуре, приводя к выравниванию нуклеосом с одним и тем же составом по одной линии [alignment] или в стопку ( рис. 14.7 в). Таким образом, раздельно модифицированные перемежающиеся нуклеосомы НЗ и фланкирующий гетерохроматин могли бы отвечать за сборку трехмерной структуры CEN-хроматина в митозе ( Sullivan and Karpen, 2004 ). Такое расположение может быть необходимо, чтобы экспонировать хроматин CENP-A внешней стороне хромосомы, где он может рекрутировать кинетохорные белки таким образом, который устанавливает правильную двойную ориентацию сестринских кинетохоров по отношению к полюсам веретена.
